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Quelle différence de rayon de giration des protéines peut être considérée comme significative ?

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Dans les simulations de dynamique moléculaire des protéines, le rayon de giration est souvent utilisé pour évaluer la compacité d'une protéine.
Lorsque l'on compare le rayon de giration de deux protéines, quelle différence peut être considérée comme significative 1 angström, 5 angströms, 10 angströms ? Signification significative : oui c'est certainement plus compact ou non ce n'est certainement pas plus compact. J'ai cherché mais je n'ai trouvé aucune référence à ce sujet.


Quelle différence de rayon de giration des protéines peut être considérée comme significative ? - La biologie

Le papillome inversé (IP) est un type de tumeur dans lequel les cellules épithéliales de surface se développent vers le bas dans le tissu de soutien sous-jacent. La vessie, le bassinet du rein, l'uretère, l'urètre, le nez et les sinus paranasaux sont tous des zones possibles pour l'apparition d'IP [ 1 ]. Épistaxis et obstruction nasale avec douleurs faciales ou céphalées atteintes lorsque la muqueuse nasale ou sinusale porte l'IP [2]. Bien que l'IP provenant de la membrane respiratoire périphérique appartient à une tumeur épithéliale bénigne, le caractère invasif local, le taux de récidive plus élevé et la transformation maligne rendent le traitement difficile [ 3 ]. Le taux de transformation maligne est de 5�% et beaucoup d'entre elles sont synchrones et présentent un carcinome épidermoïde [ 4 ]. Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) agit comme une expression antigénique dans les noyaux cellulaires dans la phase de synthèse de l'ADN au cours du cycle cellulaire et considère le pronostic du cancer, mais la relation avec IP est encore controversée [ 5 ].

La cycline et la kinase dépendante de la cycline (CDK) jouent un rôle important dans le cycle cellulaire pendant la prolifération et affectent différentes phases du cycle cellulaire [ 6 &# x2013 9 ]. Le CDK1 est un initiateur crucial de la prolifération cellulaire et du facteur de transformation maligne [ 10 ]. Au contraire, les inhibiteurs de p21, P27 et CDK, limitent les CDK et arrêtent le cycle cellulaire [ 8 ]. Le p21 est un inhibiteur des CDK de la phase cellulaire G1 qui restreignent l'entrée des cellules dans la phase S. Le p27 pourrait également se lier aux CDK et agir comme CDKI en tant que p21. Le p27 interagit avec les complexes cycline E-CDK2, cycline A-CDK2 et cycline D1-CDK4, affectant la prolifération cellulaire et l'apoptose [ 6 , 7 ].

L'antigène marqueur de prolifération Ki-67, détecté avec l'anticorps monoclonal MIB-1, est exprimé dans toutes les phases cellulaires G1, S, G2 et M sauf G0 [ 8 ]. L'expression du Ki-67 était également corrélée au comportement de la tumeur, au grade pathologique de la tumeur et à la récidive précoce dans divers carcinomes [11 – 15].

Concernant les IP transformées ou synchrones avec des cancers, nous réalisons également l'étude IHC p16, p53, Ki-67, et PLUNC (palate, lung, and nasal epithelium clone protein). La p16 est une protéine suppresseur de tumeur qui ralentit la phase cellulaire G1 à S et prévient la transformation maligne [ 8 ]. PLUNC est un matériel immunitaire inné qui a un effet anticancéreux pour le cancer du nasopharynx mais aucune étude n'a révélé sa pertinence pour les IP nasosinusiennes [ 16 ].

Des enquêtes PCNA, p53, p21, p27 et Ki-67 ont été réalisées pour voir si elles étaient corrélées à l'étendue de la tumeur et au résultat du traitement des IP nasosinusiennes [ 8 ].

Le but de cette étude est d'étudier les rôles des régulateurs du cycle cellulaire p53, p21, p27, du marqueur de prolifération Ki-67, p16, PCNA et du matériel immunitaire inné PLUNC dans la récidive et la transformation maligne des IP nasosinusiennes. Nous avions également examiné si les facteurs prédits possibles de Ki-67, PCNA et p27 étaient corrélés aux CDK par simulation informatique, enfin pour donner une explication possible du mécanisme de Ki-67, PCNA et p27 aux CDK dans le pronostic des IP.

Du département de l'hôpital universitaire de médecine de Chine de janvier 2000 à juin 2010, 60 cas d'IP nasosinusiens et 10 cas d'IP avec transformation de carcinome épidermoïde ont été collectés et examinés à partir des dossiers médicaux de manière rétrospective. Tous les tissus fixés dans du formol 10&x25 et préparés dans de la paraffine ont été utilisés pour les études IHC par la méthode du complexe avidine-biotine-peroxydase. Anticorps monoclonaux de souris (mAb), anti-p16 (Neomarkers, DCS-50, 200 mg/L), anti-p21 (Neomarkers, MS 387-P, 200 mg/L), anti-p27 (Neomarkers, MS 256 -P, 200 mg/L), anti-p53 (Neomarkers, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarkers RM 9106-S) PCNA et PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ont été utilisés pour l'immunohistochimie par la méthode streptavidine-biotine peroxydase [ 11 ]. Le xylène a été utilisé pour déparaffiner l'ensemble des coupes tissulaires puis réhydraté par des séries d'alcools, et enfin saturé en eau distillée. Ensuite, le tissu a été transféré dans une solution saline tamponnée au phosphate avec l'ajout d'une solution à 0,3 x 25 de peroxydase hydrogène pour bloquer l'activité de la peroxydase endogène à température ambiante pendant 10 x 2009 min, puis le tampon Tris a été rincé par la suite. Les sections ont ensuite été bouillies dans un four à micro-ondes pendant 15 x 2009 min dans une solution tampon de citrate (10 x 2009 mmol/L pH, 6,0). Les anticorps primaires p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 et PLUNC ont été appliqués un par un pendant 60 x 2009 min à température ambiante [ 11 ].

Ensuite, nous ajoutons un anticorps de liaison et un complexe de streptavidine peroxydase (kit DAKO LSAB, K-0675 Carpinteria, CA) pendant 15 x 2009 min à température ambiante. Le tétrachlorhydrate de diaminobenzidine (DAB) 0,05 &# a été utilisé pendant 15 2009 min pour la coloration des tissus et finalement lavé deux fois par le tampon Tris [ 8 , 11 ].

Les sections ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline Mayer&# x2019s après lavage à l'eau déminéralisée. Les noyaux immunocolorés ont été quantifiés dans chaque cas. Tout le comptage a été effectué sous un microscope optique standard dans un champ de 1000x pour évaluer les noyaux positifs/nombre total de cellules. Dix champs ou au moins 500 cellules ont été comptés sur chaque section. Les coupes tumorales étaient considérées comme négatives si la coloration était absente ou présente dans 㰐% des cellules tumorales. Un score de 1+ a été attribué lorsque 10 des cellules étaient positives à la réaction. Un score de 2+ a été attribué lorsque 30 % des cellules étaient positives à la réaction. Un score de 3+ a été attribué lorsque > 50% des cellules étaient positives à la réaction, respectivement (tableaux 1 et 2) [17]. La signification statistique a été analysée à l'aide du test du chi carré de Pearson ou du test exact de Fisher pour l'analyse univariée et un test de régression logistique multiple a été utilisé pour l'analyse multivariée. Les résultats étaient considérés comme statistiquement significatifs lorsque la valeur P était de < 0,05.

La corrélation des résultats IHC avec la récurrence multiple en univariant par carré de Pearson Xi et analyse de régression logistique multivariante.

La corrélation des résultats IHC avec la transformation maligne en univariant par carré de Pearson Xi et analyse de régression logistique multivariée.

L'amarrage protéine-protéine a été réalisé par le programme ZDOCK [ 18 ] pour analyser les trois facteurs pronostiques possibles pour la transformation maligne liée à CDK1. Pour rendre le mécanisme possible à ce que nous avons trouvé dans cette étude, nous calculons l'interaction du Ki-67, p27 et PCNA à CDK1 par biologie computationnelle. Nous avons en outre utilisé le programme GROMACS 4.5.5 [ 19 ] pour observer la stabilité des complexes après les prédications de liaison ZDOCK. L'environnement du système MD a été défini dans la modélisation de l'eau TIP3P avec une boîte à eau à une distance de 1,2 x 2009 nm qui contenait des ions Na et Cl à une concentration de 0,145 x 2009 M de NaCl pour la neutralisation du système. Tout d'abord, nous avons défini des étapes de 5 000 cycles dans l'algorithme de descente la plus raide pour la minimisation de l'énergie. Deuxièmement, les conditions de dynamique à température constante (type NVT) ont été utilisées pour fournir une simulation MD pour l'équilibrage et réalisées sur une période de 1 & x 2009 n. Dans la dernière étape, la dynamique de pression et de température constante (type NPT) a été définie pour le cycle de production sur une période de 5 000 & x 2009ps. La température du système pendant le processus de simulation a été fixée à 310 K. Pour l'analyse de trajectoire, nous avons utilisé le logiciel GROMACS 4.5.5 pour compter respectivement l'écart quadratique moyen (RMSD) et le rayon de giration (Rg). Des séries de données de conformation MD ont été étudiées tous les 20 % de tous les cycles de production.

Il y avait un total de 55 hommes et 15 femmes inclus dans cette étude. Soixante d'entre elles sont des IP et les 10 autres sont des IP nasosinusiennes collectées avec transformation maligne. L'âge est de 45,64 ans ± 14,45 ans allant de 25 à 78 ans. Les colorations ont révélé des niveaux significativement élevés de PLUNC, mais des niveaux réduits de Ki-67, p53, p21 et p27 chez les patients présentant une récurrence multiple des IP (tableau 1). Nous avons également trouvé des PCNA, Ki-67 et p27 élevés dans les IP nasosinusiennes avec transformation du carcinome épidermoïde par rapport aux IP nasosinusiennes seules sans malignité synchrone (tableau 2). L'expression élevée de PLUNC est corrélée à la chirurgie des sinus multiples chez les patients présentant des IP nasosinusiennes. Cependant, le niveau d'expression de PLUNC n'est pas corrélé à la transformation maligne des IP en SCC. Nous avons également montré l'expression IHC de différents niveaux pour PCNA, Ki-67, p27 et PLUNC dans les figures 1, 2, 3 et 4. L'IRM ou la tomodensitométrie préopératoire ont toutes été réalisées pour tous les patients comme dans les Figures 5 et 6 .

L'expression PCNA IHC (a) +++ et (b) 0 dans les IP.

L'expression Ki67 IHC (a) +++ et (b) 0 dans les IP.

L'expression p27 IHC (a) +++ et (b) 0 dans les IP.

L'expression PLUNC IHC (a) +++ et (b) 0 dans les IP.

Vue sinoscopique d'un papillome inversé nasosinusien avec transformation maligne.

IRM sinusale (vue coronaire) et tomodensitométrie sinusale (vue axiale) d'un papillome inversé naso-sinusien avec transformation maligne.

La coloration immunohistochimique Ki-67 élevée se trouve dans les deux IPs nasosinusiennes avec des récidives multiples et une transformation maligne dans notre analyse univariée et multivariée par le test du chi carré de Pearson et le test de régression logistique multiple comme le montrent les tableaux 1 et 2 et la figure 2 (a ) . Par conséquent, un indice Ki-67 élevé pourrait être considéré comme un facteur important pour le pronostic et les marqueurs prédits malins. Nous pourrions même combiner l'enquête sur le niveau d'expression significativement accru de Ki-67 et PCNA IHC et le niveau inférieur de p27 pour prédire la tendance de transformation maligne plus élevée chez les patients présentant des IP nasosinusiennes dans notre enquête.

Nous avons par conséquent effectué des analyses d'amarrage avec des études de dynamique moléculaire finale entre ce que nous avons trouvé les facteurs pronostiques de PCNA et CDK1, Ki-67 et CDK1, et p27 et CDK1 qui ont tous montré un amarrage stable dans la figure 7 et leur score d'amarrage est également montré dans par programme ZDOCK. Le ZDOCK a généré les 10 meilleures poses d'amarrage de CDK1 et Ki-67, CDK1-p27 et CDK1-PCNA. Nous avons choisi le meilleur score d'amarrage pour analyser la stabilité de l'interaction protéine-protéine. Le Ki-67, p27 et PCNA au score de liaison CDK1 sont de 20,92, 21,72 et 24,32, respectivement par le programme ZDOCK. Les résidus clés sont Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15 qui étaient les principaux domaines de liaison pour Ki-67 et p27 au CDK1 montré dans le ruban rouge (figure 7). Nous avons en outre effectué une analyse MD de ces résidus clés pour voir l'interaction de ces trois protéines avec la CDK1. Après la simulation MD du complexe CDK1 avec Ki-67, p27 et PCNA, nous avons effectué l'analyse RMSD pour des temps de simulation de 5000 & x2009ps. Les trois protéines (Ki-67, p27 et PCNA) se sont révélées avoir une fluctuation stable après un temps de simulation de 1000 & x2009ps (Figure 8).

Les meilleures poses d'amarrage de CDK1 (vert) avec la protéine cible (bleu) : (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA. Les dix meilleurs complexes protéine-protéine avec les scores ZDOCK ont été générés par le programme ZDOCK. Les scores ZDOCK les plus élevés de Ki-67, p27 et PCNA sont respectivement de 20,92, 21,72 et 24,32. Les résidus de liaison clés de Ki-67 et p27 sont colorés en rouge et les résidus clés comprennent Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15.

L'analyse RMSD de tous les atomes des complexes CDK1 avec (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant des temps de simulation de 5000 ps. Tous les complexes ont tendance à fluctuer de manière stable après un temps de simulation de 1000 & x2009ps.

Dans la figure 9, nous avons calculé la giration du rayon des protéines pour une période de simulation de 5000 x 2009. Les trois complexes ont tendance à avoir de faibles valeurs de rayon de giration et une fluctuation stable sur toutes les simulations MD, ce qui indique les complexes compactés entre chacune des structures protéiques. La méthode SASA (zone de solvant) a été utilisée pour la nature hydrophobe des trois complexes, ces trois sont devenus une fluctuation stable et ont également montré un changement hydrophobe stable entre chaque interaction protéine-protéine (figure 10). Outre le calcul de l'énergie totale des systèmes MD pour chacun des trois complexes pendant des temps de simulation de 5000 ps, ils avaient tous une variation d'énergie stable dans la plage de 𢄩.27 × 10 5 , 𢄩.30 × 10 5 et 𢄡.66 × 10 6 , respectivement (Figure 11 ). Le résultat de l'analyse énergétique révèle que tous les systèmes de simulation sont stables pendant 5000 ps. Dans l'analyse de fluctuation des résidus, nous mesurons la valeur RMSF de tous les résidus pour les trois complexes (figure 12). Dans la validation RMSF du complexe CDK1-Ki67, des fluctuations significatives sont observées sur les résidus de 38 à 43 de CDK1, qui ont beaucoup changé au cours de la simulation MD (Figure 12 (a)). Il y avait également une variation significative observée dans les résidus de 25 à 40 sur la structure de la protéine p27 au cours de la simulation MD qui dénote les grands changements dans cette région. Au contraire, il y a moins de variation RMSF dans les résidus de 100 à 200 sur la structure de la protéine PCNA lors de la simulation MD. Par conséquent, il y avait moins de changement de RMSF pendant la simulation MD dans PCNA que Ki-67 et p27.

Le rayon de giration des complexes CDK1 avec (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant des temps de simulation de 5000 ps. Les faibles valeurs de rayon de giration indiquent les complexes compactés entre deux structures protéiques.

L'analyse SASA (zone de solvant) de la conformation de tous les complexes pour la définition hydrophobe pendant 5000 & x2009ps, la fluctuation stable n'a indiqué aucun changement distinct entre les interactions protéine-protéine.

Calcul de l'énergie totale des systèmes MD de (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant des temps de simulation de 5000 ps, chacune des fluctuations moyennes est de 𢄩.27 × 10 5 , 𢄩. 30 × 10 5 et 𢄡.66 × 10 5 , respectivement.

Analyse RMSF des résidus de protéines sur (a) CDK1 et Ki-67, (b) CDK1 et p27, et (c) CDK1 et PCNA pendant le temps de simulation de 5000 ps. La valeur élevée de la fluctuation RMSF dénote une forte variation de la structure de la protéine sur toutes les simulations MD.

Cependant, l'analyse de la migration a révélé que PCNA avait une grande distance entre CDK1 par rapport à Ki-67 et p27 lors d'une enquête de simulation MD 5000 ps. Bien que nous ayons trouvé la plus grande distance entre PCNA et CDK1 (figure 13(a)), mais leur liaison stable a été montrée sur la figure 12 par analyse RMSF. De plus, le déplacement quadratique moyen (MSD) de PCNA a une migration plus petite (Figure 13 (b)). Nous analysons en outre les résidus clés de CDK1 pour la liaison Ki-67 et p27. Le résidu de liaison clé comprend Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15 sur l'angle des dièdres de la structure de la protéine Ki67-CDK1 pendant le temps de simulation de 5000 ps. Tous les résidus de liaison sont stables pendant toute la simulation MD. Cependant, il n'y avait que des angles dièdres stables dans Gly9, Ser10, Leu12 et Val15 sur les complexes protéiques p27-CDK1 pendant tout le temps de simulation MD. Enfin, nous avons constaté que tous les résidus de liaison clés, y compris Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15 sur la structure de la protéine PCNA-CDK1 avaient un angle de dièdre de liaison stable pendant toute la simulation MD, aucun changement plus important n'a été trouvé au cours du processus de PCNA se liant à CDK1 (figure 14). Les analyses de cluster ont été utilisées pour sélectionner la structure représentative parmi toutes les bases MD. Pour le test de comparaison d'instantanés, la structure représentée sélectionnée parmi les derniers groupes de regroupement pour toutes les trames MD des complexes CDK1 de Ki67, P27 et PCNA déplacées à 4860 & x2009ps, 2740 ps et 3880 ps, respectivement, pendant le temps de simulation de 5000 & #x2009ps (Figure 15 ). L'étude comparative d'instantanés pour CDK1 et les protéines cibles pour Ki-67, p27 et PCNA sont illustrées à la figure 16. Nous avons constaté que les résidus de CDK1 de 38 à 43 sur CDK1 se rapprochent de Ki-67 de 0 ps à 4860 ps (Figure 16(a)). Le résultat est corrélé à l'analyse RMSF en raison des fortes fluctuations sur les résidus de 38 à 43 de CDK1 se lie pour Ki-67. Pour l'analyse d'instantané CDK1-p27, p27 se rapproche de CDK1 de 0 ps à 2740 ps. Les résultats sont également corrélés à l'analyse RMSF en raison de fortes variations sur les résidus de 25 à 40 de p27 se lie à CDK1 (figure 16(b)). Nous n'avons pu trouver que le petit changement d'une boucle PCNA (bleue) qui s'éloigne de CDK1 (vert) à 3880 & x2009ps à des résidus de 100 à 200 sur l'interaction PCNA et CDK1 (Figure 16 (c)). Ce résultat est également corrélé à l'analyse RMSF pour les petites fluctuations sur les résidus de 100 à 200 de PCNA se lie à CDK1.

L'analyse de la migration des complexes pendant le temps de simulation de 5000 ps : (a) la distance entre CDK1 et les protéines amarrées sur tout le temps MD et (b) l'analyse du déplacement quadratique moyen (MSD) pour tous les complexes CDK1 la valeur élevée de MSD dénote la distance élevée de migration des protéines forme la position initiale.

L'angle des dièdres des résidus de liaison des clés : (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 et (g) Val15 sur la structure de la protéine CDK1 pendant le temps de simulation de 5000 ps. Les angles dièdres ont été calculés pour les complexes CDK1 avec des protéines de liaison cibles : Ki-67, p27 et PCNA sur tout le temps de simulation MD.

Analyses groupées de toutes les CDK1 et des protéines de liaison : (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant le temps de simulation de 5000 & x2009ps, les structures représentées ont été sélectionnées parmi les derniers groupes de regroupement pour toutes les trames MD de CDK1 complexes. La structure représentée du complexe Ki-67, p27 et PCNA déplacée à 4860 & x2009ps, 2740 ps et 3880 ps, respectivement.

Comparaison entre l'instantané initial (0 ps) et la conformation représentée pour tous les complexes CDK1. (a) L'une des boucles CDK1 (verte) s'est déplacée vers Ki-67 (bleu) à 4860 ps. (b) La structure protéique de p27 (bleu) liée à CDK1 (vert) plus étroitement à 2740 & x2009ps. (c) L'une des boucles PCNA (bleue) s'est éloignée de CDK1 (vert) à 3880 ps.

Pour résumer les résultats de notre étude et des revues de la littérature, le mécanisme moléculaire de Ki-67, p27 et PCNA interagissant avec CDK1 pour la prolifération des cellules et la transformation maligne chez les patients atteints d'IP nasosinusienne est illustré à la figure 17.

Le mécanisme moléculaire de Ki-67, p27 et PCNA dans le cycle cellulaire.

Bien que les papillomes inversés se soient rarement produits dans le tractus nasosinusien, mais la nature récurrente facile et la transformation maligne perturbent souvent les patients et les médecins.Un suivi régulier tout au long de la vie est nécessaire pour la détection précoce d'une récidive ou d'un changement malin et pourrait conduire à un meilleur contrôle de la maladie chez les patients IP [9, 20].

Le Ki-67 a favorisé l'initiation de la phase G1 à partir de G0 dans les cellules IPs, et il a persisté l'expression du cycle cellulaire en phase de prolifération. Ki-67 est une protéine qui affecte le cycle cellulaire dans la phase de prolifération de G1-S-G2-M à l'exception de la phase G0 [ 8 , 11, 14 ]. Dans la littérature rapportant les mutations p53, p63, p21 et p27 induites par IP nasosinusienne avec transformation du SCC, il y avait encore des débats [ 6 , 11 , 14 ]. Ki-67 est récemment rapporté à la survenue de néoplasmes naso-sinusiens [ 21 ] le comportement tumoral agressif corrélé à un indice Ki-67 plus élevé et a provoqué une dysplasie sévère de l'épithélium nasal et même un carcinome épidermoïde [ 22 ]. Le Ki-67 élevé pourrait même être trouvé dans les carcinomes épidermoïdes contenus de manière synchrone dans les IP. Ki-67 affectera également p21, p27 et CDK [8, 11, 12, 14]. Cependant, nous n'avons pas pu conclure si la diminution de p27 est causée par une expression élevée de Ki-67 dans les tissus IPs nasosinusiens. Une étude plus approfondie est nécessaire pour élucider la relation entre Ki-67 et P27.

La fonction de suppression tumorale de p53 est liée à de nombreux cancers rapportés par Katori et al. et Gujrathi et al. [ 22 , 23 ]. Ils ont suggéré que le test de p53 peut aider à dépister les lésions du papillome avec un potentiel de dysplasie ou de carcinome, mais nous n'avons pas trouvé cela significatif dans l'analyse multivariée. Ceci est dû au nombre limité de patients dans notre étude. Cependant, non seulement p53 mais aussi p63 est élevé exprimé dans les IP avec transformation maligne [ 11 ].

Une activité proliférative accrue avec une expression élevée de Ki-67 des cellules tumorales a été signalée comme un marqueur pronostique important dans de nombreuses tumeurs humaines, il est également important dans la récurrence des IP et la cancérisation. En particulier, le suspect Ki-67 affecte directement le cycle cellulaire pendant la phase de prolifération et pourrait interagir avec les gènes suppresseurs de tumeur p53, p21 et p27 et moduler le cycle cellulaire en affectant le point de contrôle de la phase G1 [8, 24, 25]. Le Ki-67 a récemment découvert une interaction entre CDK1 dans la structure naturelle et la biologie moléculaire [ 26 ] et CDK1 joue le rôle principal dans la prolifération cellulaire et même la transformation maligne [ 10 ]. Nous soupçonnons que le Ki-67 a non seulement initié l'entrée des cellules IPs dans la phase G1 du cycle cellulaire, mais a également provoqué une transformation maligne dans les noyaux cellulaires en affectant le CDK1.

Les rôles cliniques de p21 et p27 dans la cancérisation du CEC de la tête et du cou font encore l'objet de débats, mais nous avons constaté que le niveau inférieur de p27 était également révélé dans les IP nasosinusiennes avec transformation maligne dans notre étude. Bien qu'il y ait eu peu d'études sur p21 et p27 rapportant la corrélation entre les IP humaines et la cancérisation, les débats subsistaient. Certains étaient avec Oncel et al. [ 11 , 27 ] et certains étaient contre [ 25 , 28 ] observés.

Outre Ki-67, nous avons également trouvé le PCNA, un prédicteur de la transformation maligne des IP dans la collaboration avec CDK1. Dans nos IP avec transformation maligne, le PCNA et le Ki-67 ont tous deux été élevés par les colorations IHC.

Comme l'expression élevée de PCNA l'a montré dans l'IP avec transformation maligne d'après notre enquête, nous avons suspecté que le PCNA était un facteur important pour induire la cancérisation chez les patients atteints d'IP nasosinusienne. Récemment, on a également trouvé le PCNA élevé dans IP par rapport aux polypes nasosinusiens de Mumbuc et al. [ 3 ]. Le PCNA pourrait interagir avec CDK1 et favoriser l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire pour la prolifération et la cancérisation qui en résultent.

Enfin, nous étudions le PLUNC aux IP naso-sinusiennes avec cancérisation car il est fréquemment rapporté qu'il est à l'origine de la formation du cancer du nasopharynx. Dans notre étude précédente, l'expression de PLUNC était diminuée dans la sinusite à pseudomonas en cas de maladie chronique [29]. Le PLUNC était également corrélé à la rhinosinusite chronique à colonisation bactérienne multiple [ 17 ]. Et, en plus, le PLUNC était également censé avoir une fonction anti-infectieuse et antibiofilm [30, 31]. Parce qu'il était supposé avoir un effet anticancéreux sur le carcinome du nasopharynx [ 32 ], mais nous n'avons trouvé aucune corrélation entre les IP nasosinusiennes et la transformation du CSC. Au contraire, nous n'avons pu trouver l'expression élevée de PLUNC que chez les patients présentant des IP nasosinusiennes avec des récidives multiples et une chirurgie de révision des sinus. Le mécanisme supplémentaire et les raisons de l'expression élevée de PLUNC et des récurrences multiples devraient être étudiés plus en détail à l'avenir.

La conception de médicaments assistée par ordinateur (CADD) peut être utilisée pour approfondir la recherche clinique ou sur les maladies, notamment la recherche sur les maladies [ 33 ], les études sur les facteurs de risque [ 34 ], les rapports de cas et le mécanisme moléculaire. Dans nos résultats d'amarrage et de dynamique moléculaire de PCNA, Ki-67 et p27 à CDK1, nous avons constaté que tous les trois avaient un amarrage stable à CDK1. Et le p27 était censé avoir une interaction plus stable avec le CDK1 pour fonctionner comme inhibiteur des IP nasosinusiennes avec cancérisation. Le PCNA et le Ki67 ont été considérés comme des promoteurs et favorisent la prolifération cellulaire et la cancérisation dans les IP nasosinusiennes.

En conclusion, il s'agit d'une première étude montrant que le Ki-67, le PCNA et le p27 sont tous importants dans les récidives IP et la cancérisation via CDK1. Et nous sommes également les premiers à trouver une expression PLUNC élevée dans les IP nasosinusiennes à récurrence multiple. Cependant, une étude plus approfondie des mécanismes est toujours justifiée à l'avenir. Les études informatiques actuelles sont toutes compatibles avec nos études en laboratoire humide, ce qui rend notre étude plus fiable et pourrait s'appliquer au traitement futur des patients atteints de cette maladie. Par conséquent, les patients présentant une IP nasosinusienne et exprimant un Ki-67 élevé, un PCNA et une diminution de p27 doivent être considérés comme ayant des possibilités plus élevées de transformation maligne et doivent être suivis de plus près dans la pratique clinique [35].


Clonage moléculaire et caractérisation d'un (Lys)6-Tagged Hémoglobine réactive aux sulfures I de Lucina pectinata

Une étiquette poly-Lys a été fusionnée au Lucina pectinata séquence codante de l'hémoglobine I (HbI) et purifiée à l'aide d'un procédé efficace et rapide. L'HbI est une héméprotéine qui se lie au sulfure d'hydrogène (H2S) avec une affinité élevée et il a été utilisé pour comprendre les réactions physiologiquement pertinentes de cette molécule de signalisation. Le (Lys)6-la construction rHbI marquée a été exprimée dans E. coli et purifié par immobilisation sur une matrice échangeuse de cations, suivie d'une chromatographie d'exclusion stérique. L'identité, la structure et la fonction de la (Lys)6-la rHbI marquée a été évaluée par spectrométrie de masse, diffusion de rayons X petite et large, spectroscopie optique et analyse cinétique. Les résultats de diffusion et de spectroscopie ont montré que la (Lys)6-tagged rHbI est structurellement et fonctionnellement analogue à la protéine native ainsi qu'à la (His)6-marqué rHbI. Etudes de cinétique avec H2S a indiqué que l'association (k au) et la dissociation (k désactivé) les constantes de vitesse étaient respectivement de 1,4 × 10 5 /M/s et 0,1 × 10 −3 /s. Ces résultats ont confirmé que la (Lys)6-tagged rHbI lie H2S avec la même affinité élevée que son homologue.

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Résultats

La digestion à la trypsine donne des peptides stables et résistants à la digestion (DRP) pour toutes les isoformes de conglutine

Les isoformes de conglutine d'arachide, Ara h 2.02, Ara h 2.01 et Ara h 6, ont été digérées par incubation avec de la trypsine. La figure supplémentaire S1 montre l'évolution dans le temps de la digestion telle que visualisée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium (SDS-PAGE) dans des conditions réductrices. Les peptides issus de la digestion restent stables jusqu'au terme de 180 minutes de notre étude pour toutes les isoformes de conglutine. Les DRP de l'isoforme Ara h 2.02 se composent de deux groupes, avec des masses moléculaires apparentes d'environ 12 kDa et 10 kDa. Les DRP d'Ara h 2,01 présentent un poids moléculaire apparent d'environ 10 kDa et un examen attentif de cette zone révèle deux bandes de co-migration. Les DRP d'Ara h 6 migrent sous forme de bandes d'environ 9 kDa et 5 kDa. Pour une caractérisation plus poussée, des DRP préparés par digestion pendant 90 minutes ont été utilisés. Dans des conditions physiologiques utilisant de la pepsine à faible pH suivie de trypsine/chymotrypsine à pH neutre, les conglutines d'arachide sont également résistantes à la protéolyse. Les DRP résultants ont des poids moléculaires similaires à ceux analysés dans notre étude et peuvent toujours se lier aux IgE (données non présentées), conformément à d'autres études 13,22.

Identification de séquences de DRP à partir d'isoformes de conglutine d'arachide

Des spectres de masse à haute résolution ont été enregistrés pour les DRP non réduits et réduits et alkylés des isoformes Ara h 2, Ara h 2.02 et Ara h 2,01 et Ara h 6. Spectres ESI-MS des DRP non réduits et réduits et alkylés sont représentés sur les figures 1 et 2, respectivement. Pour les DRP non réduits, une large gamme d'ions m/z avec des états de charge plus élevés (de +8 à +17) est observée, ce qui représente des masses avec des masses moléculaires >13 kDa. Les spectres de masse de ces DRP non réduits contiennent également des ions m/z avec des états de charge inférieurs (de +2 à +6), représentant les masses <5 kDa. Les DRP réduits et alkylés donnent une plage d'états de charge de +4 à +12, représentant les masses de 2,2 à 10 kDa. Dans les spectres des DRP réduits et alkylés, on peut observer qu'un ion d'état de charge donne plusieurs masses m/z, s'écartant de 57 Da les unes des autres. Ceci concerne l'alkylation partielle des cystéines. Le tableau supplémentaire S1 résume les masses trouvées pour les DRP, à la fois sous forme non réduite et sous forme réduite et alkylée. La trypsinolyse d'Ara h 2,02 et 2,01 a conduit à des DRP de masses moléculaires de 16,2 à 17,6 kDa, ainsi qu'à certains petits peptides de 2 à 4 kDa (voir le tableau supplémentaire S1). Ara h 6 a montré des DRP de masses moléculaires de 13,5 à 14,1 kDa. En tenant compte de la modification post-traductionnelle connue, du traitement post-traductionnel et de la combinaison des masses de DRP intactes et réduites et alkylées à l'aide de la cartographie des liaisons disulfure 19, les masses expérimentales étaient liées aux masses théoriques (voir le tableau supplémentaire S1).

Les DRP non réduits ont été soumis à ESI-MS pour déterminer les masses de peptides individuels. Les peptides peuvent être liés par des liaisons disulfure. Panel a : DRP d'Ara h 2.02 Panel b : DRP d'Ara h 2.01 Panel c : DRP d'Ara h 6.

Des DRP réduits et alkylés ont été soumis à un ESI-MS pour déterminer les masses de peptides individuels. Panel a : DRP d'Ara h 2.02 Panel b : DRP d'Ara h 2.01 Panel c : DRP d'Ara h 6.

Des profils d'électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) de DRP à partir d'isoformes de conglutine individuelles (voir la figure supplémentaire S2) ont été utilisés pour attribuer des points, où différentes valeurs de pi des DRP ont fourni des instructions supplémentaires pour la vérification des peptides. La figure 3 donne un aperçu des séquences peptidiques trouvées dans les DRP des trois conglutines d'arachide. Après digestion, nous avons détecté des protéines avec une liaison peptidique hydrolysée sur l'Arg59/71 pour Ara h 2 et Arg50 pour Ara h 6 (Fig. 3. Panneau a - Ara h 2.02, peptides a et b Panneau b - Ara h 2.01, peptides b, c, d et e Panneau c - Ara h 6, peptides a et b) , qui après réduction donne deux peptides avec des poids moléculaires de 7,2 à 9,7 kDa pour Ara h 2 et de 4,8 à 9,4 kDa pour Ara h 6. Dans les DRP intacts d'Ara h 2, un traitement protéolytique C-terminal du fragment Y/RY a été observé 29, mais aussi un clivage au site de clivage de la trypsine Arg149/137-Aspic150/138. De plus, les peptides avec des segments courts internes supprimés (S48TR50 en Ara h 6 et D61PYSPSPYDRR71 dans Ara h 2.02) ont été détectés. Dans les DRP d'Ara h 2, des segments internes ont été détectés à partir de l'Asp35 ou Asp42 (Fig. 3. Panneau a - Ara h 2.02 peptides f, g et h, Panneau b - Ara h 2.01 peptide f). Ces peptides courts ne contiennent pas de résidus cystéine et ne restent pas associés au noyau protéique stable. L'extrémité N-terminale de l'Ara h 6 après digestion a montré une certaine diversité de l'extrémité N-terminale (protéolyse à Arg5 ou Arg7, Fig. 3. Panneau c – Ara h 6 peptides a–d). Pour les trois conglutines, les parties les plus sensibles à la digestion sont les extrémités N et C et, dans une moindre mesure, une partie interne limitée. Il est évident que dans les trois isoformes de conglutine, le principal site interne d'attaque de la trypsine est structurellement identique (R59|R60|D61PYSSPPYDRR71|G72 en Ara h 2.02, R58|R59|G60 en Ara h 2.01 et R47|S48TR50|S51 dans Ara h 6), situé dans la boucle qui ne porte pas de structure locale définie. La figure supplémentaire S3 contient l'alignement des séquences des isoformes de conglutine avec l'attribution d'éléments de structure secondaire et un diagramme de topologie 2D montrant les ponts disulfure.

En utilisant la séquence des conglutines intactes (ligne supérieure de chaque panneau), les peptides identifiés sont indiqués par les lignes suivantes (indiquées par des lettres). Chaque ligne représente un peptide unique trouvé. Les lignes marquées d'un « R » représentent les peptides libérés du noyau protéique lors de la digestion. Panneau a : séquences des DRP de l'espèce de protéine Ara h 2.02 Panneau b : séquences des DRP de l'espèce de protéine Ara h 2.01 Panneau c : séquences des DRP de l'espèce de protéine Ara h 6.

La structure secondaire des isoformes de conglutine d'arachide n'est pas affectée par la digestion et la simulation dynamique moléculaire révèle des structures conformationnellement stables des DRP

Des spectres de dichroïsme circulaire (CD) en UV lointain ont été acquis à pH 8 et pH 1,2, à 37 °C, afin de mieux comprendre les propriétés structurales des DRP d'Ara h 2.02, Ara h 2.01 et Ara h 6. Les spectres de les trois isoformes natives montrent une forte ellipticité positive de 200 à 190 nm, indiquant typiquement la présence de structures -hélicoïdales (tracés linéaires sur la figure 4). La forme des spectres CD UV lointains des DRP est similaire à celle des protéines natives (tracés en tirets sur la figure 4). Le passage à zéro, c'est-à-dire la longueur d'onde à 0 mdeg d'ellipticité, est le même pour les DRP et les isoformes natives, confirmant qu'aucun changement notable dans la structure secondaire ne s'est produit à la suite de la dégradation de la protéine intacte en fragments plus petits. Les conglutines natives et leurs DRP ont des spectres CD UV lointains hautement comparables à pH neutre et à pH bas, indiquant qu'aucune dénaturation ne se produit dans l'estomac.

Les conglutines natives et leurs DRP ont été analysées par spectroscopie CD UV de loin pour étudier le contenu de la structure secondaire, à la fois à pH neutre et à pH bas pour imiter les conditions gastriques et duodénales. Les lignes pleines représentent les conglutines d'arachide natives, les lignes pointillées représentent les DRP des conglutines respectives. Panneaux supérieurs (a,b,c) à pH = 8,0, panneaux inférieurs (d,e,f) à pH=1,2. Panneaux de gauche (a,d) : Ara h 2.02 Panneaux du milieu (b,e) : Ara h 2.01 Panneaux de droite (c,f) : Ara h 6.

Pour analyser les conséquences de l'action protéolytique pour les trois isoformes, une simulation de dynamique moléculaire a été réalisée sur les protéines intactes et digérées pendant 500 ns pour Ara h 2 et 800 ns pour Ara h 6. Selon les fluctuations de la moyenne quadratique du squelette (RMSF ), on peut remarquer que les deux isoformes d'Ara h 2 ont trois régions à forte mobilité : la partie N-terminale flanquante jusqu'à la première Cys, la partie C-terminale du dernier résidu Cys à la fin de la séquence, et une région qui est presque toute la boucle non structurée entre le deuxième et le troisième résidu Cys (Fig. 5a,b). La mobilité des régions Ara h 6 est similaire, sauf que la partie C-terminale n'est pas mobile en raison d'un disulfure situé à l'extrémité C-terminale de la protéine (Fig. 5c). Les sites de clivage de la trypsine sont marqués d'une flèche sur la figure 5 pour les DRP et ceux-ci sont pris en compte pour une analyse plus poussée de la dynamique moléculaire. De plus, les figures 5d–f montrent des sites de clivage sensibles à la trypsine pour tous les DRP identifiés dans cette étude (figure 3). On peut observer que les valeurs RMSF de presque tous les sites sensibles à la trypsine trouvés dans cette étude sont supérieures à 0,60 , (Fig. 5d–f), tandis que les sites résistants à la trypsine présentent pratiquement tous des valeurs RMSF inférieures à 0,70 Å. En effet, la valeur prédictive positive de la sensibilité des sites de coupe cibles dans les conglutines d'arachide à la trypsinolyse est de 83 %, pour la résistance à l'action protéolytique est de 87 %, si la valeur de coupe RMSF était fixée à 0,65 .

Panneaux supérieurs (a,b,c) : conglutines intactes, panneaux inférieurs (d,e,f) : sites affectés par la trypsine dans les DRP. Panneaux de gauche (a,d) : Ara h 2.02 Panneaux du milieu (b,e) : Ara h 2.01 Panneaux de droite (c,f) : Ara h 6.Les flèches indiquent les endroits qui sont affectés par la trypsine La ligne bleue représente la séquence protéique Les lignes vertes représente les parties de séquences protéiques qui contiennent l'hélice car la structure secondaire C représente la cystéine qui est impliquée dans la formation de la liaison disulfure.

Quatre minima locaux de RMSF ont pu être observés avec <0,5 , correspondant aux régions -hélicoïdales (Fig. 6), c'est-à-dire le noyau protéique hautement structuré. Selon la figure 6, qui représente les valeurs RMSF chevauchées de la protéine intacte avec ses DRP correspondants, la mobilité locale des DRP démontre un modèle similaire, y compris les régions -hélicoïdales avec des minima RMSF. La figure 7 représente la structure 3D de la protéine intacte chevauchée avec son DRP correspondant. Dans les DRP, seul un petit changement conformationnel a pu être observé, pour Ara h 2 dans la boucle non structurée et la région C-terminale, et pour Ara h 6 des déviations sont observées dans la boucle non structurée et la région N-terminale , tandis que les régions -hélicoïdales sont restées dans leur structure hélicoïdale sans aucun mouvement hélicoïdal ni réarrangement pour toutes les isoformes de conglutine (Fig. 7), et deviennent même légèrement moins dynamiques. Ces résultats indiquent que la protéolyse ne modifie pas substantiellement la stabilité conformationnelle des protéines.

Panneau a : Comparaison d'Ara h 2.02 et de son DRP (Fig. 3a, peptide d) Panneau b : Comparaison d'Ara h 6 et de son DRP (Fig. 3c, peptide d). Les flèches représentent les minima du RMSF dont la position est située dans la région -hélicoïdale de la protéine. Les lignes vertes représentent les parties des séquences protéiques, qui contiennent l'hélice comme structure secondaire.

Panneau a : Ara h 2.02 Panneau b : Ara h 6. La structure en rouge représente la conformation des protéines intactes et la structure en bleu représente la DRP (peptide d de la figure 3a, c). Les flèches montrent les sites de clivage, indiquant que les parties non structurées sont affectées.

L'écart quadratique moyen (RMSD) et le rayon de giration des DRP ont été calculés en évaluant les écarts spatiaux dans la structure. Cette analyse a en outre confirmé la compacité des DRP (voir les figures supplémentaires S4 et S5). Pendant toute la durée de la simulation, les DRP d'Ara h 2 et d'Ara h 6 présentent un profil RMSD inférieur, suggérant qu'elles sont plus stables que les protéines intactes correspondantes.

Les valeurs du rayon de giration (Rg) révèlent un tracé inférieur des DRP pendant toute la durée de la simulation et impliquent que les DRP ont une conformation sensiblement plus compacte par rapport à la protéine intacte. La structure plus compacte des DRP que les protéines intactes correspondantes (avec un effet plus prononcé dans le cas d'Ara h 2), ainsi que la compacité plus élevée d'Ara h 6 que d'Ara h 2, sont conformes aux changements des éléments de structure secondaire des protéines au cours de la simulation (voir Fig. supplémentaire S6), par ex. teneur en hélices sensiblement plus élevée dans les DRP que dans les protéines Ara h 2 intactes et teneur en hélices plus élevée dans Ara h 6 que dans Ara h 2.Cela peut s'expliquer par la perte de séquences d'acides aminés non structurées entraînant une fraction plus élevée d'éléments structurés dans les produits de digestion.

Les peptides résistants à la digestion présentent des propriétés de liaison aux IgE comme les isoformes de conglutine natives

La liaison aux IgE des DRP d'Ara h 2 et d'Ara h 6 a été évaluée par électrophorèse sur gel 2D combinée à un immunoblot. La figure 8a montre que les trois isoformes ont donné lieu à des taches de liaison aux IgE. Les DRP d'Ara h 6 ont des pis plus acides que les DRP des isoformes d'Ara h 2 . L'immunotransfert IgE révèle également des taches supplémentaires avec des poids moléculaires plus élevés. Cela représente une petite fraction d'Ara h 6 intact, qui reste après 90 min de digestion, comme noté sur SDS-PAGE et 2-DE. Les taches qui ne se liaient pas aux IgE (à <10 kDa et avec un pi acide) semblaient provenir d'Ara h 6 (Fig. 8a et Fig. supplémentaire S2).

Panneau a : électrophorèse 2-D (gauche) et électrophorèse 2-D avec immunotransfert IgE de DRP du mélange Ara h 2/h 6. M : marqueurs moléculaires Panel b-d : puissance de liaison aux IgE telle que déterminée par IgE-ELISA de peptides résistants à la digestion (lignes pointillées) et de conglutine native (lignes pleines). Un exemple typique est montré (Panneau b : Ara h 2.02 Panneau c : Ara h 2.01 Panneau d : Ara h 6). Les pouvoirs de liaison des IgE des DRP sont similaires à ceux des conglutines intactes.

De plus, le pouvoir de liaison aux IgE des DRP par rapport à celui de la conglutine d'arachide intacte a été évalué à un niveau quantitatif par IgE-ELISA. La figure 8 (panneaux b–d) montre les tracés d'inhibition d'Ara h 2.02, Ara h 2.01 et Ara h 6 et leurs DRP. Pour Ara h 2.02 et Ara h 6, les tracés d'inhibition des DRP se chevauchent virtuellement avec ceux des protéines intactes. Pour Ara h 2.01, il y a un léger décalage vers une concentration plus élevée, suggérant une puissance de liaison aux IgE légèrement inférieure. À partir de trois expériences indépendantes, le CI moyen50 valeurs (la concentration nécessaire pour inhiber 50% du signal) ont été obtenues et le facteur d'augmentation de l'IC50 la valeur entre les DRP et les protéines intactes a été déterminée. Pour Ara h 2,02, Ara h 2,01 et Ara h 6, cette augmentation était respectivement de 0,8 (± 0,4), 1,4 (± 1,4) et 1,5 (± 0,6). Comme ces nombres sont proches de 1, on peut conclure que le pouvoir de liaison aux IgE des trois isoformes de conglutine d'arachide n'est pas affecté par la trypsinolyse.


Résultats

Pour élucider la dynamique des protéines membranaires périphériques, nous avons utilisé la dynamique dissipative des particules (DPD), une technique de simulation à gros grains couramment utilisée pour simuler les membranes à l'échelle mésoscopique [30]. Dans cette approche, des groupes d'atomes sont combinés pour former des billes efficaces qui sont les éléments constitutifs de constructions plus complexes, par ex. lipides et protéines. Les billes interagissent via des potentiels efficaces et sont soumises à un thermostat (voir Méthodes pour plus de détails).

(a) Modèle d'un lipide L avec une seule tête hydrophile (gris) et trois billes de queue hydrophobes (jaune). (b) Une protéine modèle avec rayon consistait en une seule couche hexagonale (billes de diamètre) de billes hydrophiles (rouge) et trois couches de billes de queue hydrophobes (bleu). (c) Instantané d'une membrane de lipides L et de cinq copies intégrées de (l'eau n'est pas montrée pour une meilleure visibilité).

Pour modéliser un système d'eau, de lipides et de protéines membranaires périphériques, nous avons utilisé trois types de billes qui représentent des groupes hydrophiles, des groupes hydrophobes et de l'eau. Les lipides (notés ) ont été construits sous forme de polymères linéaires constitués d'un seul groupe de tête hydrophile et de billes de queue hydrophobes (figure 1 a). Comme lipide standard, nous avons utilisé . Les protéines membranaires périphériques (notées ) ont été modélisées sous forme de cylindres à section transversale hexagonale, constitués d'une couche de billes hydrophile et hydrophobe qui forment l'ancre membranaire (figure 1 b). Les billes à l'intérieur du cylindre ont été connectées à des ressorts harmoniques pour obtenir des structures protéiques assez rigides et compactes similaires à celles observées dans la nature en raison des interactions covalentes et non covalentes de la chaîne polypeptidique. Le rayon des protéines a été déterminé par le nombre de billes le long de la section transversale hexagonale d'une protéine, . Nous nous sommes concentrés sur les PMP avec une longueur d'ancrage à membrane. Dans toutes les simulations, les protéines ont été insérées dans des bicouches lipidiques pré-assemblées avec une taille de patch de (Figure 1 c). Ici, l'échelle de longueur DPD intrinsèque correspond à . Avant d'enregistrer les positions de toutes les billes en fonction du temps, les systèmes ont été équilibrés avec un barostat jusqu'à un état sans tension (cf. Méthodes).

Perturbation des bicouches lipidiques par les protéines membranaires périphériques

Nous avons d'abord caractérisé une bicouche lipidique constituée de lipides sans aucune protéine incorporée. L'épaisseur de cette bicouche était (distance moyenne entre les centres des groupes de tête lipidiques des feuillets opposés cf. Figure 2). L'épaisseur d'une foliole était (distance moyenne entre les centres des groupes de tête et les centres terminaux des perles de la queue à l'intérieur d'une foliole cf. Figure 2). La distance entre les feuillets était (distance moyenne entre les centres des perles de queue terminales dans les feuillets opposés cf. figure 2). Le paramètre d'ordre d'orientation des lipides, , étant l'angle moyen entre les lipides et la normale à la bicouche, a pris une valeur . Compte tenu des extrêmes (lorsque les lipides sont orientés parallèlement à la normale de la bicouche, pour une orientation aléatoire), la valeur observée indique une bicouche lipidique assez ordonnée mais fluide.

Lors de l'intégration d'un PMP dans une bicouche lipidique, les deux feuillets sont perturbés de manière caractéristique. Les régions entre les positions moyennes des billes de la tête lipidique et de la queue terminale dans les deux folioles sont représentées par des bandes colorées. Le plan médian neutre non perturbé est indiqué par une ligne pointillée. Un seul PMP a été inséré dans le feuillet inférieur (forme indiquée dans la région ). L'épaisseur de membrane et de feuillet non perturbée, et , sont indiqués loin de la protéine. (a) Lors de l'insertion de protéines courtes (c'est-à-dire et ) le feuillet supérieur s'est plié vers le plan médian non perturbé tandis que le feuillet inférieur est resté presque non perturbé. (b) Pour les ancres membranaires plus longues ( ), le feuillet supérieur s'est replié du plan médian en raison de l'interférence stérique des lipides avec la fraction hydrophobe opposée de la protéine. La foliole inférieure ne se plie que légèrement vers l'intérieur, ce qui entraîne un épaississement local de la membrane. De plus, l'épaisseur du feuillet supérieur, , était légèrement réduite en raison de la compression stérique.

Afin de sonder les altérations de la forme de la bicouche et de la configuration des lipides lors de l'intégration d'une protéine membranaire périphérique dans la membrane, nous en avons inséré une seule avec un rayon et une longueur hydrophobe croissante ( ) dans la bicouche. Après équilibrage, l'inclinaison de la protéine par rapport à la bicouche normale était très modeste ( ). Seule la protéine la plus courte, , a montré une inclinaison quelque peu améliorée ( ) avec des fluctuations accrues. Ce dernier se reflète également dans la distribution des angles d'inclinaison des protéines qui était légèrement plus large que pour tous les autres PMP (données non présentées). Cette observation suggère que cela suppose une configuration légèrement moins stable dans la membrane par rapport aux protéines avec des fragments hydrophobes plus longs.

Ensuite, nous avons surveillé le profil de section transversale perturbé de la membrane, c'est-à-dire les positions moyennes des centres des groupes de tête lipidiques et des centres de perles de queue lipidiques terminaux. En général, des perturbations marquées étaient visibles dans les régions membranaires proches de la protéine (Figure 2 a). Lorsque le fragment hydrophobe de la protéine n'a pas atteint le feuillet opposé ( et , figure 2 a), le feuillet opposé était partiellement plié vers le plan médian non perturbé. Le feuillet dans lequel la protéine était incluse est resté presque non perturbé et, par conséquent, la membrane était plus mince près de la protéine, c'est-à-dire. La moindre perturbation a été observée pour laquelle la longueur de la partie hydrophobe ( ) correspondait approximativement à l'épaisseur du feuillet non perturbé ( ). Pour les PMP avec une fraction hydrophobe plus longue ( ), le feuillet opposé s'est plié en dehors du plan médian (Figure 2 b). Les déviations absolues du plan médian à la limite du PMP ont augmenté presque linéairement avec la longueur de la fraction hydrophobe, c'est-à-dire pour . Le feuillet dans lequel le PMP a été intégré ne s'est que légèrement plié dans la même direction (Figure 2 b), c'est-à-dire qu'une augmentation nette de l'épaisseur de la membrane ( ) près de la protéine a émergé.

Nous avons ensuite déterminé l'épaisseur des feuillets membranaires, c'est-à-dire la distance moyenne des têtes lipidiques et des extrémités de la queue dans un feuillet. Le feuillet dans lequel la PMP était incorporée n'a changé d'épaisseur que marginalement quelle que soit la protéine insérée (données non présentées). Le feuillet opposé à la PMP, cependant, a montré des changements significatifs en fonction de la longueur de la partie hydrophobe (figure 3 a). En particulier, une forte compression du feuillet a émergé tandis qu'une longueur du fragment hydrophobe n'avait qu'un effet négligeable car le fragment hydrophobe était trop court pour pénétrer fortement dans le feuillet opposé. Cette constatation pour et est corroborée par l'observation que les lipides ont montré une diminution du paramètre d'orientation, c'est-à-dire qu'ils s'alignaient moins avec la bicouche normale, lorsqu'ils étaient situés juste en face de ces protéines (Figure 3 b). Cependant, des protéines plus courtes ont également induit un changement d'orientation des lipides dans le feuillet opposé : ici, les lipides se sont alignés plus fortement avec la bicouche normale, c'est-à-dire augmentés. Dans le feuillet dans lequel la protéine était incorporée, l'orientation des lipides était également affectée à proximité de la PMP. Près de , les lipides étaient inclinés plus fortement, alors qu'ils s'alignaient plutôt mieux le long de la normale de surface pour les protéines avec une fraction hydrophobe plus longue. Ainsi, dans tous les cas, la liberté des lipides est contrainte, c'est-à-dire s'écarte de la valeur non perturbée, ce qui est entropiquement défavorable.

(a) Lors de l'insertion d'une construction, l'épaisseur du feuillet opposé est considérablement modifiée à proximité de la protéine par rapport à la valeur non perturbée. La compression du feuillet augmente lorsque la longueur de la partie hydrophobe est augmentée. (b) Le paramètre d'ordre d'orientation des lipides (l'angle moyen des lipides par rapport à la normale de la bicouche) dans les feuillets supérieur et inférieur est également affecté à proximité d'un PMP. Seulement loin de la protéine, une convergence vers la valeur non perturbée est observée. En accord avec la compression locale du feuillet supérieur, une plus forte inclinaison des lipides est observée directement à l'opposé de la PMP. Légende comme en (a).

Pour compléter les résultats ci-dessus, nous avons également analysé la distance moyenne entre les feuillets, c'est-à-dire la distance moyenne des centres des billes lipidiques terminales dans chaque feuillet (voir également la figure 2). En conséquence, nous avons trouvé une distance réduite ( ) à proximité de la protéine la plus courte, , alors qu'aucun changement par rapport à n'a été observé. Pour les protéines plus longues ( ), la distance augmente de , , et , respectivement.

En résumé, nos résultats sur l'inclinaison lipidique et l'épaisseur de la bicouche sont en accord avec les observations précédentes [31]. Au-delà de ces résultats, nous avons également quantifié les perturbations de chaque monocouche et la longueur de couplage altérée des monocouches.

Diffusion des protéines membranaires périphériques

Après avoir quantifié les perturbations membranaires locales induites par l'enrobage d'une protéine membranaire périphérique dans une bicouche lipidique, nous nous sommes ensuite demandé comment ces protéines diffusent au sein de la membrane. Pour les protéines transmembranaires, la célèbre relation de Saffman-Delbruck [32] prédit une dépendance logarithmique de la taille pour les petits rayons ( ) (1) Ici, et sont l'épaisseur et la viscosité de la membrane, est le rayon de la protéine, est la constante d'Euler, et est le somme des viscosités du fluide au-dessus ( ) et au-dessous ( ) de la membrane [33]. La validité de l'équation. (1) a été confirmée par des simulations [34] et des expériences [35]–[37].

Pour sonder si la diffusion dépendante de la taille des protéines membranaires périphériques est également décrite par l'Eq. (1) , nous avons intégré des PMP uniques ( ) de rayons variables ( ) dans une bicouche lipidique ( ). En raison de l'utilisation de potentiels de noyau mou dans le DPD, le transport de quantité de mouvement et de masse se produit sur la même échelle de temps, permettant ainsi une bonne quantification des propriétés de transport même dans des systèmes assez petits. Après équilibrage, la position d'une protéine a été suivie pour les étapes. Au cours de cette période, les protéines se sont déplacées en moyenne sur une distance de . A partir de la série chronologique des positions, nous avons déterminé le déplacement quadratique moyen (moyenne dans le temps) de la protéine. Le coefficient de diffusion a été obtenu par la suite en ajustant le déplacement quadratique moyen. L'incertitude dans la détermination du coefficient de diffusion était inférieure à celle jugée à partir de plusieurs essais pour les mêmes réglages de paramètres. A titre de référence, nous avons également déterminé les coefficients de diffusion d'une protéine transmembranaire avec 5 couches de billes hydrophobes et d'un seul lipide. Ce dernier a donné le coefficient de diffusion auquel tous les coefficients de diffusion des protéines ont été comparés.

De la même manière que dans le cas d'une membrane qui sépare deux fluides de viscosités différentes, nous avons prévu des PMP car le sommet d'une protéine sent l'eau environnante tandis que son fond est enfoui au cœur de la bicouche. Par conséquent, on s'attendait à ce que la profondeur de pénétration de la protéine varie. Par conséquent, a été utilisé comme paramètre d'ajustement ouvert dans l'équation. (1) . Le deuxième paramètre d'ajustement était .

En conséquence, nous avons trouvé que l'équation. (1) fournit un excellent ajustement aux coefficients de diffusion dépendants de la taille de toutes les protéines simulées (Figure 4 a). Contrairement à nos attentes, n'a pas montré de variation significative lorsque la profondeur de pénétration de la protéine a été augmentée en allongeant la longueur de la fraction hydrophobe (figure 4 b). Cependant, le changement de était proportionnel à la longueur de la fraction hydrophobe de la protéine (Figure 4 b). Ce résultat reflète que la protéine ne subit pas la traînée visqueuse complète ( ) d'une protéine transmembranaire mais seulement une partie plus petite en raison de la profondeur de pénétration plus petite. Notamment, le coefficient de diffusion pour presque coïncidé avec celui d'une protéine transmembranaire. Dans nos simulations, nous n'avons pas observé d'anneau significatif de lipides voyageant avec la protéine. Très probablement, le grain grossier et l'utilisation de potentiels mous (c'est-à-dire un faible rapport impulsion/propagation de masse inhérent à la DPD) adoucissent l'émergence de ces assemblages dynamiques à courte portée attendus.

(a) La dépendance du coefficient de diffusion d'une protéine membranaire périphérique sur son rayon est bien décrite par l'équation. (1) désigne le coefficient de diffusion d'un lipide, est la taille d'une bille de simulation. Les protéines avec sont désignées par des cercles pleins, des losanges, des carrés et des cercles vides, des carrés, respectivement. Les barres d'erreur sont plus petites que la taille du symbole. Attention : Pour une meilleure visibilité, les courbes correspondant à avoir été décalées d'un facteur, les courbes non décalées coïncident approximativement avec la courbe la plus haute. (b) La viscosité dans l'Eq. (1) (montré ici comme quantité sans dimension) ne varie pas systématiquement lors de l'augmentation de la profondeur de pénétration d'une protéine. En revanche, la viscosité de surface (indiquée comme quantité sans dimension) montre une augmentation linéaire avec la profondeur de pénétration.

Lors de la dissection, c'est-à-dire l'extraction de la contribution de la membrane, il est à noter que bien que les deux proviennent du frottement avec les lipides. Nous attribuons cette différence aux différents contacts qu'un PMP fait avec les lipides : alors que le fond de la protéine est principalement en contact avec les billes lipidiques de la queue, la face latérale est immergée dans des chaînes lipidiques allongées. En comparant les coefficients de diffusion des PMP, nous constatons qu'ils varient au maximum entre la profondeur de pénétration la plus basse ( ) et la plus grande ( ). Ainsi, à l'instar des protéines transmembranaires à mésappariement hydrophobe [38], [39] la variation de la mobilité diffusive est très modérée.

Regroupement de protéines membranaires périphériques au sein d'un même feuillet

Étant donné que les protéines membranaires périphériques perturbent la bicouche lipidique et réduisent les degrés de liberté des lipides, on peut s'attendre à un regroupement dynamique et entropique des protéines par analogie aux observations faites pour les protéines transmembranaires [10]. Nous avons donc étudié dans un premier temps le comportement de clustering de deux protéines membranaires périphériques qui résident dans le même feuillet.

Pour sonder et caractériser les interactions à médiation membranaire des protéines membranaires périphériques, nous avons déterminé l'énergie libre d'association entre deux PMP. À cette fin, nous avons quantifié le potentiel de force moyenne (PMF), via un échantillonnage parapluie de la distribution des distances interprotéiques (voir [40], [41] pour une introduction détaillée). Ici, nous avons restreint notre analyse à des paires de protéines identiques et varié les rayons des protéines ( ) et les longueurs de la fraction hydrophobe ( ).

En conséquence, nous avons constaté que le PMF pour toutes les paires de PMP dans le même dépliant avait un minimum profond à de petites distances interprotéiques (Figure 5 a), c'est-à-dire lorsque les protéines sont situées côte à côte. Cette caractéristique indique un état lié, c'est-à-dire la formation d'un dimère (transitoire). Au-delà du minimum dans le PMF, 2 à 3 minima latéraux faibles ont émergé, ce qui reflète très probablement des configurations métastables avec 1 à 2 lipides entre les PMP. Pour les grandes distances interprotéiques, le PMF converge vers une constante, c'est-à-dire que les PMP n'interagissent pas sur de plus grandes distances.

(a) Potentiels représentatifs de force moyenne, , de deux PMP ( ) résidant dans le même feuillet. Le minimum de est situé à la distance anticipée où les protéines se touchent (ligne pointillée). L'énergie de liaison augmente avec la longueur hydrophobe croissante de la protéine ( , représentée respectivement en noir, rouge et vert). Des instantanés représentatifs indiquent la configuration de la protéine à l'état lié et non lié. Les groupes hydrophiles et hydrophobes sont indiqués en rouge/gris et bleu/jaune, respectivement. (b) L'énergie de liaison augmente avec la longueur de la partie hydrophobe, . Alors que l'on n'observe pour les petits rayons ( ) qu'une très faible augmentation de l'énergie de dimérisation, une forte augmentation est observée pour les plus grands rayons ( ).

La profondeur du minimum principal par rapport à la valeur PMF loin de la protéine, c'est-à-dire, reflète la force de liaison et détermine donc la stabilité du dimère. En fonction de la longueur de la fraction hydrophobe et du rayon de la protéine, nous avons observé des valeurs dans la plage (Figure 5 b). Des valeurs expérimentales comparables ont été rapportées pour l'association à médiation membranaire des hélices transmembranaires ( ) [42]. Nous avons observé l'énergie de liaison la plus faible pour et la liaison la plus forte pour (Figure 5 b). Pour une longueur donnée de la partie hydrophobe, augmentée avec les rayons protéiques. Fait intéressant, la largeur du minimum principal changeait à peine avec le rayon de la protéine lorsque les PMP étaient assez courtes ( : largeur ). Pour les fragments hydrophobes plus longs ( ), la largeur augmente progressivement avec le rayon (jusqu'à ).

Pour relier le PMF à la stabilité réelle des dimères, nous avons ensuite calculé les temps moyens de premier passage du minimum d'énergie à l'état non lié. En résolvant le problème de Kramers pour un puits de potentiel carré, la prédiction est que dépend quadratiquement de la largeur du potentiel et exponentiellement de la profondeur du potentiel ( ). Par conséquent, la contribution dominante pour la stabilité du dimère est . À la suite de l'intégration complète, nous avons trouvé s ms (cf. tableaux S1,S2).À titre de comparaison, nous avons également surveillé la durée de vie des dimères préformés qui peuvent se dissocier en raison du mouvement diffusif. Les durées de vie accessibles de cette approche étaient en très bon accord avec les temps de premier passage moyens calculés ci-dessus.

En résumé, nous avons trouvé une attraction à médiation membranaire entre les PMP dans le même feuillet qui est améliorée pour augmenter la longueur et le rayon de la fraction hydrophobe. En particulier, nous avons observé que les profondeurs potentielles étaient plutôt petites ( ) lorsque l'ancre hydrophobe des protéines ne pénétrait pas dans le feuillet opposé. Pour les protéines avec des longueurs et des rayons hydrophobes, nous avons trouvé des valeurs plus élevées qui mettent en évidence une tendance significative des protéines à se dimériser. Il convient de noter ici que le regroupement des PMP dans le même dépliant a également été étudié dans une étude de simulation connexe [31], mais le PMF n'a pas été déterminé. Les auteurs ont observé une augmentation de la taille des amas lorsque les protéines pénétraient également dans le feuillet opposé alors que presque aucun amas n'a été observé pour les protéines limitées à un seul feuillet. Ces observations sont cohérentes avec les valeurs énergétiques trouvées ici.

Regroupement de protéines membranaires périphériques dans des feuillets opposés

Pour élucider si les protéines membranaires périphériques interagissent également et se dimérisent potentiellement lorsqu'elles sont situées dans des feuillets opposés d'une bicouche, nous avons inséré une seule protéine dans chacun des deux feuillets ( et ) et déterminé à nouveau le potentiel de force moyenne (PMF). Comme ci-dessus, nous avons systématiquement fait varier les rayons des protéines ( ) et la longueur des fragments hydrophobes ( ).

Semblable à nos résultats ci-dessus, tous les PMF ont montré un minimum profond à une petite distance interprotéique qui indiquait un état dimérisé métastable (Figure 6 a). Contrairement aux PMP dans le même feuillet, le minimum du PMF était ici typiquement situé à une très petite distance ( ), c'est-à-dire que les PMP formaient des dimères de feuillets croisés dans lesquels les protéines individuelles prenaient une configuration empilée (voir les instantanés de la figure 6 a) . Le minimum global était parfois suivi d'une petite barrière répulsive à des distances intermédiaires qu'il fallait franchir pour atteindre l'état dimérisé. L'énergie de liaison, , dépendait du rayon de la protéine et de la combinaison des longueurs hydrophobes , (Figure 6 b). La liaison la plus forte a été trouvée pour les combinaisons d'un PMP très court et d'un PMP long ( et ). Les combinaisons qui impliquaient un PMP qui correspondait le mieux en une seule monocouche ( ) présentaient des valeurs moyennes de (avec ). La liaison la plus faible a été observée pour , , et les combinaisons de et . Pour augmenter les rayons des protéines, la forme caractéristique du PMF a été préservée, mais la profondeur du puits de potentiel ( ) a augmenté, c'est-à-dire que les dimères sont devenus plus stables. Il convient de noter ici qu'une liaison extraordinairement forte, , a émergé pour le plus grand rayon ( , c'est-à-dire un diamètre de protéine de 3 à 4 nm). Compte tenu de la simplicité de notre modèle et des effets inévitables de taille finie qui peuvent supprimer une partie des ondulations et des modes de bicouche péristaltique pertinents, cette valeur peut être une surestimation. Malgré quelques corrections numériques que l'on peut anticiper pour ces cas extrêmes, la tendance globale à stabiliser les dimères pour des rayons croissants est un résultat cohérent de nos simulations.

(a) Potentiels représentatifs de force moyenne, , de deux PMP ( ) résidant dans des feuillets opposés. Pour les combinaisons de protéines suffisamment courtes ( , courbe noire , courbe rouge) le minimum de émerge à des distances de fuite. Car une légère augmentation de est observée à la suite de la construction des PMP via des billes finies, c'est-à-dire que la configuration (i) est énergétiquement moins favorable que l'arrangement (ii). Pour les protéines plus longues ( , courbe verte), une disposition côte à côte des PMP est observée, et le minimum de par conséquent est déplacé vers de plus grandes distances. Des instantanés représentatifs indiquent que les arrangements discutés, les groupes hydrophiles et hydrophobes sont indiqués en rouge/gris et bleu/jaune, respectivement. (b) Diagramme de phase pour la capacité de dimérisation lors du changement des longueurs d'ancrage membranaire et d'une paire de PMP. Les valeurs codées par couleur indiquent la force de liaison. Veuillez noter que l'échelle logarithmique des valeurs de codage couleur est marquée en noir.

La forme du dimère dépendait de manière significative de la longueur des fragments hydrophobes des PMP impliqués (cf. instantanés sur la figure 6 a). Lorsque la longueur hydrophobe des deux PMP était suffisamment petite (ou ), les protéines formaient un dimère en forme de pile (disposition de bas en bas), et la largeur du minimum global dans le PMF était à peu près le diamètre des protéines. Par conséquent, les protéines s'attiraient tant qu'elles se chevauchaient. Pour de plus grandes distances, une petite partie répulsive a émergé dans le PMF, reflétant le travail qui doit être fait pour réorganiser les lipides et les protéines avant que le dimère puisse se former. La hauteur de cette barrière répulsive était la plus élevée lorsque les deux protéines étaient très courtes ( , ) ou, dans une moindre mesure, lorsque l'une était très longue ( , ). En particulier, la combinaison de deux protéines très courtes ( ) a produit une barrière énergétique de si bien qu'une dimérisation spontanée de ces protéines est très improbable. Lorsque les ancres hydrophobes des deux protéines ont pénétré dans le feuillet opposé ( et ), les partenaires de dimérisation étaient situés côte à côte (cf. instantané sur la figure 6 a). Le bassin attractif du PMF dans ce cas était très similaire aux résultats pour les PMP dans le même feuillet, c'est-à-dire qu'au-delà d'une distance interprotéique de pratiquement aucune attraction n'a pu être observée.

Comme précédemment, nous avons également calculé les temps moyens de premier passage comme mesure de la durée de vie du dimère (cf. Tableaux S3,S4). Par rapport aux PMP résidant dans le même feuillet, les dimères de feuillets croisés étaient généralement plus stables en raison de minima plus profonds et plus larges dans le PMF. Les temps d'échappement allaient de s à 100 ms et au-delà, ce qui indique qu'une large gamme de dimères de feuillets croisés assez stables peut se former. Encore une fois, sonder la stabilité d'un dimère préformé en surveillant la dissociation entraînée par diffusion des protéines a donné des durées de vie similaires.

En résumant nos résultats, nous avons découvert que la modification du rayon et/ou de la longueur hydrophobe d'une paire de protéines membranaires périphériques fournit un moyen d'induire un regroupement en feuillets croisés de protéines initialement indépendantes. Un tel événement de dimérisation peut être considéré comme la formation d'une protéine transmembranaire métastable efficace. Nos observations suggèrent en outre que la tendance de deux protéines à former un tel dimère couvrant la membrane dépend de deux paramètres : (a) de la perturbation de la membrane par chaque protéine individuelle lorsque la protéine est plus longue ou plus courte que l'épaisseur de l'hôte monocouche, et (b) sur l'appariement hydrophobe du domaine transmembranaire effectif du dimère à feuillets croisés. En accord avec cette affirmation, nous avons trouvé qu'une combinaison de protéines a montré une forte dimérisation déjà aux plus petits rayons ( ). Alors que la longueur de chacune de ces protéines ne correspond que mal à l'épaisseur de la monocouche, le dimère résultant n'a qu'un très faible décalage hydrophobe ( et , respectivement). En revanche, les combinaisons de protéines ont montré des temps d'échappement plus longs uniquement pour les grands rayons ( ), car les rendements correspondent le mieux à l'épaisseur de la monocouche. En cas de désadaptation très forte du dimère ( ) , une dimérisation importante avec des temps d' échappement longs n'est observée que pour de très grands rayons .

Établir des assemblages de protéines plus importants

Pour examiner si un plus grand nombre de protéines membranaires périphériques dans des feuillets opposés peut montrer une oligomérisation d'ordre supérieur, nous avons inséré 5 PMP de rayon dans chaque feuillet à des positions aléatoires. Les protéines étaient libres de diffuser et de s'agréger spontanément. Pour des rayons plus grands ( ), nous n'avons intégré que 3 protéines dans chaque feuillet pour éviter les effets de taille finie. Encore une fois, les longueurs des fragments hydrophobes, des PMP ont été systématiquement modifiées.

En conséquence, nous avons retrouvé dans un premier temps la formation spontanée de dimères à feuillets croisés de PMP que nous avions déjà observé auparavant (cf. Figure 6). Par la suite, cependant, ces dimères ont montré la capacité de former des assemblages encore plus grands lorsque les dimères avaient une durée de vie suffisamment longue pour se rencontrer par diffusion (Figure 7 a). En particulier, nous avons observé la formation de trimères de dimères pré-assemblés pour une combinaison de et . A partir du cours temporel de la simulation, nous avons déterminé la durée de vie de ces trimères. Ils augmentaient avec l'augmentation des rayons de ( ), à ( ) et ( ).

Les dimères à feuillets croisés (cf. figure 6) ont montré la capacité de former des oligomères plus gros, par ex. trimères de dimères pour (à gauche) ou de grands clusters côte à côte pour (à droite).

Pour une combinaison de et nous avons observé la formation de dimères à feuillets croisés pour le plus petit rayon ( ) sans aucun regroupement ultérieur. Pour des rayons plus grands ( ), cependant, à nouveau, des trimères de dimères à feuillets croisés avec une stabilité croissante ont émergé. Dans les cas décrits, les dimères de feuillets croisés avaient une longueur de (distance moyenne des groupes de tête dans la protéine supérieure et inférieure). La partie transmembranaire efficace d'un dimère à feuillets croisés induit donc un petit mésappariement hydrophobe entraînant l'assemblage ( ) avec la bicouche non perturbée.

Nous avons également observé une dimérisation/trimérisation des dimères pour de grands rayons ( ) lorsque les dimères préformés présentaient un mésappariement hydrophobe négatif, c'est-à-dire pour et ( ), pour et ( ) et pour et ( ). Aucune oligomérisation plus élevée des dimères n'a été observée pour et , où les dimères préformés avaient un défaut d'appariement s'évanouissant ( ). Nous déduisons de ces résultats qu'une inadéquation hydrophobe absolue d'un dimère (méta)stable de deux PMP produit une attraction à médiation membranaire qui peut provoquer une oligomérisation plus élevée des dimères. Ce résultat est en accord avec l'idée que même une petite mésappariement hydrophobe d'une protéine transmembranaire produit une interaction attrayante à médiation membranaire qui peut entraîner un clustering transitoire [10], [14]. Les dimères à feuillets croisés agissent donc à cet égard de manière similaire aux protéines transmembranaires.

La formation d'un type variant de grands amas a été observée lorsque les PMP dans différentes folioles pénétraient dans la foliole opposée ( , ) (Figure 7 b). Ces clusters n'étaient pas constitués d'entités transmembranaires efficaces comme auparavant, mais étaient plutôt un assemblage côte à côte de protéines. Le nombre moyen de protéines dans les clusters était de 3 à 6 et les durées de vie des clusters étaient (telles que déterminées à partir de l'évolution temporelle de la simulation). La taille et la stabilité des amas ont toutes deux augmenté à nouveau avec une longueur et un rayon hydrophobes croissants des PMP impliqués. Le regroupement le plus fort a été observé pour le plus grand rayon ( ). Ici, toutes les protéines de la membrane se sont assemblées en un seul grand groupe stable pendant toute la simulation ( ).

Pour compléter nos résultats, nous avons également effectué des simulations dans lesquelles une seule protéine avec un grand rayon ( ) était intégrée dans le feuillet membranaire inférieur tandis que 5 protéines avec de petits rayons ( ) étaient situées dans le feuillet supérieur. En conséquence, nous avons observé que les petites protéines ont montré une tendance à s'assembler au-dessus de la grande protéine située dans le feuillet opposé (Figure 8 a). Le degré d'assemblage, c'est-à-dire le nombre de petites protéines qui s'oligomérisent de manière stable avec la grande protéine, dépend de la combinaison des longueurs des fragments hydrophobes des protéines. Une forte oligomérisation avec des durées de vie a été observée, par exemple, pour (grande protéine) et (petite protéines). Pour ces cas, généralement deux petites protéines assemblées au-dessus d'une grande protéine. L'effet le plus fort a été observé pour et : Quatre petites protéines se sont assemblées au-dessus de la grande protéine et y sont restées pendant toute la durée de la simulation ( ). En effet, pour des raisons stériques, au mieux quatre petites protéines ( ) peuvent être placées sous une grande protéine ( ). Lorsque les petites et les grandes protéines étaient suffisamment longues pour atteindre le feuillet opposé, c'est-à-dire et , nous avons constaté que les petites protéines ne se localisaient pas au-dessus mais plutôt au bord de la grande protéine (cf. Figure 8 a). Nous avons trouvé un cluster remarquablement grand avec , , où jusqu'à quatre petites protéines entouraient la grande protéine, établissant ainsi un pentamère (durée de vie) oligomères plus petits avec la même configuration de longueur de protéine étaient stables sur toute la simulation ( ).

(a) En utilisant des protéines avec des rayons différents, on observe fréquemment un regroupement de petits PMP sous une grande protéine dans le feuillet opposé. Dans le feuillet inférieur, un seul PMP avec le rayon et la longueur de la fraction hydrophobe était intégré, tandis que le feuillet opposé hébergeait quatre PMP avec le rayon et la longueur de la fraction hydrophobe. Selon la longueur des fragments hydrophobes, jusqu'à quatre petits PMP se sont assemblés de manière stable au-dessus d'un seul PMP plus grand dans le feuillet opposé (degré de remplissage des cercles codant le nombre de petits PMP). Deux instantanés représentatifs illustrent des phénotypes représentatifs. (b) Sur des membranes non homogènes, les PMP s'assemblent également fréquemment sous ou à côté d'un microdomaine lipidique (épais) dans le feuillet opposé.

Enfin, nous avons cherché à savoir si l'assemblage de protéines décrit ci-dessus dans des feuillets opposés se produisait également lorsqu'une des protéines était remplacée par un microdomaine lipidique. À cette fin, nous avons créé une bicouche asymétrique constituée de deux types de lipides, et , où 10 % des lipides du feuillet supérieur étaient des lipides longs, . En raison des paramètres imposés (cf. Méthodes), les lipides longs ont formé un microdomaine épais ( , distance moyenne tête lipidique à queue lipidique) dans le feuillet supérieur. Un seul PMP a ensuite été inséré dans le feuillet homogène opposé. Encore une fois, nous avons systématiquement varié le rayon de la protéine ( ) et la longueur hydrophobe ( ). En conséquence, nous avons observé une co-localisation des lipides et de la PMP avec la conformation précise en fonction des paramètres de la protéine. En général, les protéines de longueur courte et moyenne ( ) se sont assemblées au-dessus du microdomaine lipidique (Figure 8 b). En revanche, pour et nous avons observé que les lipides longs se localisaient préférentiellement au bord de la protéine, parfois même l'encerclant. Ainsi, le regroupement de PMP et de microdomaines lipidiques (épais) dans le feuillet opposé est également un moyen de formation de structure sur les membranes.


Discussion

La formation de nanoclusters K-Ras, qui fonctionnent comme des commutateurs numériques transitoires à l'échelle nanométrique dans l'activation MAPK, est essentielle pour la transduction du signal Ras (5). La façon dont les nanoclusters K-Ras.GTP se forment et quel mécanisme fonctionne pour maintenir la fraction en cluster K-Ras à un niveau constant sur une large gamme de concentrations de K-Ras.GTP n'est pas résolu. Nous abordons ce problème ici en utilisant la modélisation in silico pour montrer que les interactions entre K-Ras et un pool cytosolique de Gal3 jouent un rôle central dans la conduite du nanoclustering K-Ras sur la membrane plasmique. Nous avons développé un modèle mathématique pour simuler la dynamique du nanoclustering K-Ras sur la membrane plasmique. Nous avons appliqué un algorithme génétique pour rechercher les paramètres de modèle possibles capables de réaliser les observations expérimentales et de valider les paramètres estimés optimaux représentant les mécanismes de collision. En outre, une méthode informatique a été conçue pour calculer les taux de collision de protéines sur la base de taux de diffusion de protéines et de mécanismes de diffusion déterminés expérimentalement. Les taux de collision calculés étaient constants sur une large gamme de nombres de protéines, soutenant notre utilisation d'un système de réaction homogène pour décrire la diffusion bidimensionnelle de la protéine Ras sur la membrane plasmique. Le modèle réalise avec succès la fraction constante de Ras en cluster sur la base de la biochimie connue de Gal3 et, il est important de noter, prédit qu'un mécanisme clé pour cette fraction constante est la disponibilité de la protéine Gal3 dans le cytosol pour le recrutement à la membrane plasmique. De plus, nos simulations démontrent que la probabilité de formation de complexes protéiques est un paramètre utile à utiliser en combinaison avec des taux de collision constants pour définir des taux de liaison qui réalisent des données expérimentales.

Sur la base de nos résultats publiés d'imagerie quantitative EM et FLIM-FRET (13), le modèle in silico propose que les protéines sont recrutées dans la membrane plasmique à la suite de collisions moléculaires avec des monomères K-Ras.GTP à diffusion libre. Les complexes K-Ras.GTP-Gal3 résultants s'assemblent rapidement en complexes pentamériques entraînés par des interactions moléculaires entre les protéines Gal3 constitutives. Les nanoclusters pentamères peuvent accumuler des complexes K-Ras.GTP ou K-Ras.GTP-Gal3 supplémentaires. Cependant, nos simulations montrent que la probabilité d'incorporation réussie de protéines K-Ras supplémentaires après collision avec un pentamère K-Ras.Gal3 doit être beaucoup plus faible que lors de l'assemblage du pentamère, reflétant peut-être un mécanisme de rétention biophysique différent. Une possibilité est que le complexe relativement stable de cinq protéines K-Ras ancrées à la membrane par des domaines polybasiques et un pentamère Gal3 remodèle l'environnement lipidique nanométrique du cluster. Par analogie avec le substrat de la kinase C myristoylée riche en alanine se liant à la membrane plasmique (36), le remodelage impliquerait une augmentation de la concentration locale de phospholipides acides, y compris PS et PIP2, permettant un recrutement supplémentaire de protéines K-Ras chargées positivement, mais avec une affinité inférieure à celle obtenue par interaction directe protéine-protéine Gal3.

Quel que soit le mécanisme précis, le modèle que nous avons formulé fournit fidèlement le résultat important de la formation de nanocluster K-Ras.GTP indépendante de la concentration avec la stoechiométrie K-Ras et la durée de vie du nanocluster observées précédemment (8&# x0201310). Le modèle récapitule également nos résultats expérimentaux récemment publiés montrant que la disponibilité de Gal3 dans le cytosol est le déterminant essentiel de la fraction groupée K-Ras.GTP (13). Ainsi, la modification de l'expression de Gal3 module directement la transmission du signal via K-Ras (14,37). Ces découvertes sont importantes car l'expression de Gal3 et sa localisation subcellulaire sont altérées dans un certain nombre de types de tumeurs (38). Étant donné que la fraction groupée est un déterminant essentiel de la sensibilité d'une cellule à l'activation dépendante de l'EGF de la cascade MAPK (5), les nouvelles données impliquent le pool cytosolique de Gal3 en tant que modulateur de l'activation de MAPK par l'EGF ainsi que la sortie du signal du mutant oncogène K-RasG12V. Pris ensemble, ces données impliquent une expression de Gal3 altérée dans la tumorigenèse médiée par K-Ras.

Pour un système d'équations différentielles ordinaire ayant des solutions à l'état stationnaire, les taux cinétiques dans le modèle doivent être contraints par les conditions d'équilibre du système. Cependant, nos simulations suggèrent que ce système peut ne pas être complètement équilibré par exemple, lorsque nous avons changé les valeurs de paires de paramètres, tels que une1 et 1, simultanément et proportionnellement, les propriétés d'équilibre du système ont été altérées. De plus, les distributions simulées de la taille des nanoclusters ne sont pas devenues exponentielles ni n'avaient un grand agrégat dont la taille était proportionnelle au nombre total de molécules.Ces observations suggèrent que la formation de nanoclusters est régulée par certains processus clés de non-équilibre. En effet, le système comprend un certain nombre de réactions unidirectionnelles, telles que le désassemblage de nanoclusters et la séparation de complexes Ras-Gal3 au sein de nanoclusters. De plus, la formation rapide de pentamères Gal3 entraîne des taux de liaison très différents pour l'assemblage du pentamère Ras-Gal3 par rapport à la croissance des nanoclusters en raison de collisions Ras et Ras-Gal3 supplémentaires. Une analyse plus détaillée de l'interaction entre les réactions équilibrées et déséquilibrées via les solutions en régime permanent serait intéressante à poursuivre. Cependant, ce n'est pas un exercice trivial, car notre système modélisé comprend 27 équations et les équations impliquant les espèces K-Ras.GTP, Gal3 et Ras-Gal3  sont complexes. À l'avenir, d'autres approches théoriques, telles que la méthode de l'équation principale, pourraient être utilisées pour analyser la cinétique des nanoclusters et donner un aperçu plus approfondi de la physique sous-jacente de la formation des nanoclusters.

Il a été démontré qu'un certain nombre de protéines à ancrage lipidique fonctionnent dans des nanoclusters distincts sur les feuillets interne et externe de la membrane plasmique, y compris d'autres isoformes Ras et des protéines à ancrage GPI (7𠄹,39,40). Toutes ces protéines présentent une fraction groupée indépendante de la concentration et un excès de monomère par rapport à la protéine groupée, bien qu'avec des nombres différents de protéines dans chaque nanocluster. Bien que le modèle que nous avons développé soit spécifique au nanoclustering K-Ras, au cœur du modèle se trouve un mécanisme qui favorise rapidement l'interaction coopérative entre les monomères et les dimères. Pour K-Ras, cette coopérativité est assurée par la liaison protéine-protéine. En tentant de généraliser le modèle, nous supposons qu'un mécanisme de base similaire pourrait fonctionner pour d'autres protéines nanocluster, peut-être entraîné par des interactions protéine-protéine ou protéine-lipide. Une telle hypothèse est facilement traitable par simulation et expérience et peut permettre la définition d'un principe biophysique commun pour l'organisation non aléatoire des protéines à ancrage lipidique sur la membrane plasmique.


Évaluation de la corrélation des protéines du cycle cellulaire et de l'interaction Ki-67 dans le pronostic du papillome inversé des sinus paranasaux et la transformation du carcinome épidermoïde

Le papillome inversé (IP) nasosinusien récurrent pourrait se transformer en carcinome épidermoïde nasosinusien. Nous utilisons des modèles d'expression de protéines par méthode immunohistochimique pour voir si l'expression de p53, p16, p21 et p27 appartient aux régulateurs du cycle cellulaire et au PCNA (antigène nucléaire proliférant des cellules) et Ki-67 aux marqueurs de prolifération chez soixante patients atteints d'inversion nasosinusienne. papillome, et 10 d'entre eux avec transformation de carcinome épidermoïde. Des niveaux significativement élevés de Ki-67, p27 et PCNA dans IP avec transformation de carcinome épidermoïde du tractus nasosinusien ont été révélés. Aucune variation de l'expression de p16, p21, PLUNC (protéine clonée de l'épithélium du palais, du poumon et du nez) et de p53 n'a été corrélée à la transformation maligne IP nasosinusienne par enquête multivariée. Cependant, nous avons trouvé une expression PLUNC élevée dans les adresses IP avec plusieurs récurrences. Enfin, nous avons constaté que PCNA, p27 peut interagir avec CDK1 qui favorise la prolifération des cellules IP et est en corrélation avec le carcinome épidermoïde nasosinusien. Ki-67 pourrait fonctionner tout au long des cycles cellulaires pour provoquer une transformation maligne. En conclusion, il s'agit d'une première étude montrant que la corrélation entre Ki-67, PCNA interagissant avec CDK1 pourrait conduire à une transformation maligne. L'expression élevée de PLUNC dans les IP nasosinusiennes était liée à de multiples récidives chez l'homme.

1. Introduction

Le papillome inversé (IP) est un type de tumeur dans lequel les cellules épithéliales de surface se développent vers le bas dans le tissu de soutien sous-jacent. La vessie, le bassinet du rein, l'uretère, l'urètre, le nez et les sinus paranasaux sont autant de zones possibles de survenue d'IP [1]. Épistaxis et obstruction nasale avec douleurs faciales ou céphalées atteintes lorsque la muqueuse nasale ou sinusale porte l'IP [2]. Bien que la PI provenant de la membrane respiratoire périphérique appartienne à une tumeur épithéliale bénigne, le caractère invasif local, le taux de récidive plus élevé et la transformation maligne rendent son traitement difficile [3]. Le taux de transformation maligne est de 5 à 10 % et nombre d'entre elles sont synchrones et présentent un carcinome épidermoïde [4]. Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) agit comme une expression antigénique dans les noyaux cellulaires dans la phase de synthèse de l'ADN au cours du cycle cellulaire et considère le pronostic du cancer, mais la relation avec IP est encore controversée [5].

La cycline et la kinase dépendante de la cycline (CDK) jouent un rôle important dans le cycle cellulaire pendant la prolifération et affectent différentes phases du cycle cellulaire [6-9]. Le CDK1 est un initiateur crucial de la prolifération cellulaire et du facteur de transformation maligne [10]. Au contraire, les inhibiteurs de p21, P27 et CDK, limitent les CDK et arrêtent le cycle cellulaire [8]. Le p21 est un inhibiteur des CDK de la phase cellulaire G1 qui restreignent l'entrée des cellules dans la phase S. Le p27 pourrait également se lier aux CDK et agir comme CDKI en tant que p21. Le p27 interagit avec les complexes cycline E-CDK2, cycline A-CDK2 et cycline D1-CDK4, affectant la prolifération cellulaire et l'apoptose [6, 7].

L'antigène marqueur de prolifération Ki-67, détecté avec l'anticorps monoclonal MIB-1, est exprimé dans toutes les phases cellulaires G1, S, G2 et M sauf G0 [8]. L'expression du Ki-67 était également corrélée au comportement tumoral, au grade pathologique de la tumeur et à la récidive précoce dans divers carcinomes [11-15].

Concernant les IP transformées ou synchrones avec des cancers, nous réalisons également l'étude IHC p16, p53, Ki-67, et PLUNC (palate, lung, and nasal epithelium clone protein). La p16 est une protéine suppresseur de tumeur qui ralentit la phase cellulaire G1 à S et prévient la transformation maligne [8]. PLUNC est un matériel immunitaire inné qui a un effet anticancéreux pour le cancer du nasopharynx mais aucune étude n'a révélé sa pertinence pour les IP nasosinusiennes [16].

Des enquêtes PCNA, p53, p21, p27 et Ki-67 ont été réalisées pour voir si elles étaient corrélées à l'étendue de la tumeur et au résultat du traitement des IP nasosinusiennes [8].

Le but de cette étude est d'étudier les rôles des régulateurs du cycle cellulaire p53, p21, p27, du marqueur de prolifération Ki-67, p16, PCNA et du matériel immunitaire inné PLUNC dans la récidive et la transformation maligne des IP nasosinusiennes. Nous avions également examiné si les facteurs prédits possibles de Ki-67, PCNA et p27 étaient corrélés aux CDK par simulation informatique, enfin pour donner une explication possible du mécanisme de Ki-67, PCNA et p27 aux CDK dans le pronostic des IP.

2. Matériels et méthodes

Du département de l'hôpital universitaire de médecine de Chine de janvier 2000 à juin 2010, 60 cas d'IP nasosinusiens et 10 cas d'IP avec transformation de carcinome épidermoïde ont été collectés et examinés à partir des dossiers médicaux de manière rétrospective. Tous les tissus fixés dans du formol à 10 % et préparés en paraffine ont été utilisés pour les études IHC par la méthode du complexe avidine-biotine-peroxydase. Anticorps monoclonaux de souris (mAb), anti-p16 (Neomarkers, DCS-50, 200 mg/L), anti-p21 (Neomarkers, MS 387-P, 200 mg/L), anti-p27 (Neomarkers, MS 256-P , 200 mg/L), anti-p53 (Neomarkers, RM 9105-S), Ki-67 (Neomarkers RM 9106-S) PCNA et PLUNC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ont été utilisés pour l'immunohistochimie par la méthode streptavidine-biotine peroxydase [11]. Le xylène a été utilisé pour déparaffiner l'ensemble des coupes tissulaires puis réhydraté par des séries d'alcools, et enfin saturé en eau distillée. Ensuite, le tissu a été transféré dans une solution saline tamponnée au phosphate avec ajout d'une solution à 0,3% de peroxydase hydrogène pour bloquer l'activité de la peroxydase endogène à température ambiante pendant 10 min, puis le tampon Tris a été rincé par la suite. Les coupes ont ensuite été bouillies dans un four à micro-ondes pendant 15 min dans une solution tampon citrate (10 mmol/L pH, 6,0). Les anticorps primaires p53, p21, p27, p16, PCNA, Ki-67 et PLUNC ont été appliqués un par un pendant 60 min à température ambiante [11].

Ensuite, nous ajoutons un anticorps de liaison et un complexe streptavidine peroxydase (kit DAKO LSAB, K-0675 Carpinteria, CA) pendant 15 min à température ambiante. Le tétrachlorhydrate de diaminobenzidine (DAB) à 0,05 % a été utilisé pendant 15 min pour la coloration des tissus et finalement lavé deux fois par le tampon Tris [8, 11].

Les coupes ont été contre-colorées à l'hématoxyline de Mayer après lavage à l'eau déminéralisée. Les noyaux immunocolorés ont été quantifiés dans chaque cas. Tout le comptage a été effectué sous un microscope optique standard dans un champ de 1000x pour évaluer les noyaux positifs/nombre total de cellules. Dix champs ou au moins 500 cellules ont été comptés sur chaque section. Les coupes tumorales étaient considérées comme négatives si la coloration était absente ou présente dans <10 % des cellules tumorales. Un score de 1+ a été attribué lorsque 10 à 30 % des cellules étaient positives à la réaction. Un score de 2+ a été attribué lorsque 30 à 50 % des cellules étaient positives à la réaction. Un score de 3+ a été attribué lorsque >50 % des cellules étaient positives à la réaction, respectivement (tableaux 1 et 2) [17]. La signification statistique a été analysée à l'aide du test du chi carré de Pearson ou du test exact de Fisher pour l'analyse univariée et un test de régression logistique multiple a été utilisé pour l'analyse multivariée. Les résultats étaient considérés comme statistiquement significatifs lorsque le

L'amarrage protéine-protéine a été réalisé par le programme ZDOCK [18] pour analyser les trois facteurs pronostiques possibles de transformation maligne liés à CDK1. Pour rendre le mécanisme possible à ce que nous avons trouvé dans cette étude, nous calculons l'interaction du Ki-67, p27 et PCNA à CDK1 par biologie computationnelle. Nous avons en outre utilisé le programme GROMACS 4.5.5 [19] pour observer la stabilité des complexes après les prédications de liaison ZDOCK. L'environnement du système MD a été défini dans la modélisation de l'eau TIP3P avec une boîte à eau à une distance de 1,2 nm qui contenait des ions Na et Cl à une concentration de 0,145 M NaCl pour la neutralisation du système. Tout d'abord, nous avons défini des étapes de 5 000 cycles dans l'algorithme de descente la plus raide pour la minimisation de l'énergie. Deuxièmement, les conditions de dynamique de température constante (type NVT) ont été utilisées pour fournir une simulation MD pour l'équilibrage et réalisées en une période de temps de 1 ns. Dans la dernière étape, la dynamique de pression et de température constante (type NPT) a été définie pour le cycle de production sur une période de 5000 ps. La température du système pendant le processus de simulation a été fixée à 310 K. Pour l'analyse de trajectoire, nous avons utilisé le logiciel GROMACS 4.5.5 pour compter respectivement l'écart quadratique moyen (RMSD) et le rayon de giration (Rg). Des séries de données de conformation MD ont été étudiées toutes les 20 ps de tous les cycles de production.

3. Résultats

Il y avait un total de 55 hommes et 15 femmes inclus dans cette étude. Soixante d'entre elles sont des IP et les 10 autres sont des IP nasosinusiennes collectées avec transformation maligne. L'âge est

ans allant de 25 à 78 ans. Les colorations ont révélé des niveaux significativement élevés de PLUNC, mais des niveaux réduits de Ki-67, p53, p21 et p27 chez les patients présentant une récurrence multiple des IP (tableau 1). Nous avons également trouvé des PCNA, Ki-67 et p27 élevés dans les IP nasosinusiennes avec transformation de carcinome épidermoïde par rapport aux IP nasosinusiennes seules sans malignité synchrone (tableau 2). L'expression élevée de PLUNC est corrélée à la chirurgie des sinus multiples chez les patients présentant des IP nasosinusiennes. Cependant, le niveau d'expression de PLUNC n'est pas corrélé à la transformation maligne des IP en SCC. Nous avons également montré l'expression IHC de différents niveaux pour PCNA, Ki-67, p27 et PLUNC sur les figures 1, 2, 3 et 4. L'IRM ou la tomodensitométrie préopératoire ont toutes été réalisées pour tous les patients comme sur les figures 5 et 6 .


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(b) IRM sinusale (vue coronaire) et tomodensitométrie sinusale (vue axiale) d'un papillome inversé naso-sinusien avec transformation maligne.

La coloration immunohistochimique Ki-67 élevée est trouvée dans les deux IP nasosinusiennes avec des récidives multiples et une transformation maligne dans notre analyse univariée et multivariée par le test du chi carré de Pearson et le test de régression logistique multiple, comme le montrent les tableaux 1 et 2 et la figure 2 (a). Par conséquent, un indice Ki-67 élevé pourrait être considéré comme un facteur important pour le pronostic et les marqueurs prédits malins. Nous pourrions même combiner l'enquête sur le niveau d'expression significativement accru de Ki-67 et PCNA IHC et le niveau inférieur de p27 pour prédire la tendance de transformation maligne plus élevée chez les patients présentant des IP nasosinusiennes dans notre enquête.

Nous avons par conséquent effectué des analyses d'amarrage avec des études de dynamique moléculaire finale entre ce que nous avons trouvé les facteurs pronostiques de PCNA et CDK1, Ki-67 et CDK1, et p27 et CDK1 qui ont tous montré un amarrage stable dans la figure 7 et leur score d'amarrage est également montré dans par programme ZDOCK. Le ZDOCK a généré les 10 meilleures poses d'amarrage de CDK1 et Ki-67, CDK1-p27 et CDK1-PCNA. Nous avons choisi le meilleur score d'amarrage pour analyser la stabilité de l'interaction protéine-protéine. Le Ki-67, p27 et PCNA au score de liaison CDK1 sont de 20,92, 21,72 et 24,32, respectivement par le programme ZDOCK. Les résidus clés sont Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15 qui étaient les principaux domaines de liaison pour Ki-67 et p27 au CDK1 montré dans le ruban rouge (figure 7). Nous avons en outre effectué une analyse MD de ces résidus clés pour voir l'interaction de ces trois protéines avec la CDK1. Après la simulation MD du complexe CDK1 avec Ki-67, p27 et PCNA, nous avons effectué l'analyse RMSD pour des temps de simulation de 5000 ps. Les trois protéines (Ki-67, p27 et PCNA) se sont révélées avoir une fluctuation stable après un temps de simulation de 1000 ps (figure 8).


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(c) Les meilleures poses d'amarrage de CDK1 (vert) avec la protéine cible (bleu) : (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA. Les dix meilleurs complexes protéine-protéine avec les scores ZDOCK ont été générés par le programme ZDOCK. Les scores ZDOCK les plus élevés de Ki-67, p27 et PCNA sont respectivement de 20,92, 21,72 et 24,32. Les résidus de liaison clés de Ki-67 et p27 sont colorés en rouge et les résidus clés comprennent Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15.

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(c) L'analyse RMSD de tous les atomes des complexes CDK1 avec (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant des temps de simulation de 5000 ps. Tous les complexes tendent à une fluctuation stable après un temps de simulation de 1000 ps.

Dans la figure 9, nous avons calculé la giration du rayon des protéines pour une période de simulation de 5000 ps. Les trois complexes ont tendance à avoir de faibles valeurs de rayon de giration et une fluctuation stable sur toutes les simulations MD, ce qui indique les complexes compactés entre chacune des structures protéiques. La méthode SASA (zone de solvant) a été utilisée pour la nature hydrophobe des trois complexes, ces trois complexes sont devenus une fluctuation stable et ont également montré un changement hydrophobe stable entre chaque interaction protéine-protéine (Figure 10). Outre le calcul de l'énergie totale des systèmes MD pour chacun des trois complexes pendant des temps de simulation de 5000 ps, ​​ils avaient tous une variation d'énergie stable dans la plage de -9,27 × 10 5 , -9,30 × 10 5 et -1,66 × 10 6 , respectivement (Illustration 11). Le résultat de l'analyse énergétique révèle que tous les systèmes de simulation sont stables pendant 5000 ps. Dans l'analyse de fluctuation des résidus, nous mesurons la valeur RMSF de tous les résidus pour les trois complexes (figure 12). Dans la validation RMSF du complexe CDK1-Ki67, des fluctuations significatives sont observées sur les résidus de 38 à 43 de CDK1, qui ont beaucoup changé au cours de la simulation MD (Figure 12 (a)). Il y avait également une variation significative observée dans les résidus de 25 à 40 sur la structure de la protéine p27 au cours de la simulation MD qui dénote les grands changements dans cette région. Au contraire, il y a moins de variation RMSF dans les résidus de 100 à 200 sur la structure de la protéine PCNA lors de la simulation MD. Par conséquent, il y avait moins de changement de RMSF pendant la simulation MD dans PCNA que Ki-67 et p27.


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(c) Le rayon de giration des complexes CDK1 avec (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant des temps de simulation de 5000 ps. Les faibles valeurs de rayon de giration indiquent les complexes compactés entre deux structures protéiques.


L'analyse SASA (zone de solvant) de la conformation de tous les complexes pour la définition hydrophobe pendant 5000 ps, ​​la fluctuation stable n'a indiqué aucun changement distinct entre les interactions protéine-protéine.

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(c) Calcul de l'énergie totale des systèmes MD de (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant des temps de simulation de 5000 ps, ​​chacune des fluctuations moyennes est de -9,27 × 10 5 , -9,30 × 10 5 et -1,66 × 10 5 , respectivement.

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(c) Analyse RMSF des résidus de protéines sur (a) CDK1 et Ki-67, (b) CDK1 et p27, et (c) CDK1 et PCNA pendant un temps de simulation de 5000 ps. La valeur élevée de la fluctuation RMSF dénote une forte variation de la structure de la protéine sur toutes les simulations MD.

Cependant, l'analyse de migration a révélé que PCNA avait une grande distance entre CDK1 par rapport à Ki-67 et p27 lors d'une enquête de simulation MD à 5000 ps. Bien que nous ayons trouvé la plus grande distance entre PCNA et CDK1 (figure 13 (a)), mais leur liaison stable a été montrée sur la figure 12 par analyse RMSF. De plus, le déplacement quadratique moyen (MSD) de PCNA a une migration plus petite (figure 13 (b)). Nous analysons en outre les résidus clés de CDK1 pour la liaison Ki-67 et p27. Le résidu de liaison clé comprend Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15 sur l'angle des dièdres de la structure de la protéine Ki67-CDK1 pendant le temps de simulation de 5000 ps. Tous les résidus de liaison sont stables pendant toute la simulation MD. Cependant, il n'y avait que des angles dièdres stables dans Gly9, Ser10, Leu12 et Val15 sur les complexes protéiques p27-CDK1 pendant tout le temps de simulation MD. Enfin, nous avons constaté que tous les résidus de liaison clés, y compris Gly9, Ser10, Ile11, Leu12, Lys13, Lys14 et Val15 sur la structure de la protéine PCNA-CDK1 avaient un angle de dièdre de liaison stable pendant toute la simulation MD, aucun changement plus important n'a été trouvé au cours du processus de PCNA se liant à CDK1 (Figure 14). Les analyses de cluster ont été utilisées pour sélectionner la structure représentative parmi toutes les bases MD. Pour le test de comparaison d'instantanés, la structure représentée sélectionnée parmi les derniers groupes de regroupement pour tous les cadres MD des complexes CDK1 de Ki67, P27 et PCNA déplacés à 4860 ps, ​​2740 ps et 3880 ps, ​​respectivement, pendant le temps de simulation de 5000 ps (Figure 15). L'étude comparative d'instantanés pour CDK1 et les protéines cibles pour Ki-67, p27 et PCNA sont illustrées à la figure 16.Nous avons constaté que les résidus de CDK1 de 38 à 43 sur CDK1 se rapprochent de Ki-67 de 0 ps à 4 860 ps (Figure 16 (a)). Le résultat est corrélé à l'analyse RMSF en raison des fortes fluctuations sur les résidus de 38 à 43 de CDK1 se lie pour Ki-67. Pour l'analyse d'instantané CDK1-p27, p27 se rapproche de CDK1 de 0 ps à 2740 ps. Les résultats sont également corrélés à l'analyse RMSF en raison de fortes variations sur les résidus de 25 à 40 de p27 se lie à CDK1 (Figure 16 (b)). Nous n'avons pu trouver que le petit changement d'une boucle PCNA (bleue) qui s'éloigne de CDK1 (vert) à 3880 ps à des résidus de 100 à 200 sur l'interaction PCNA et CDK1 (Figure 16 (c)). Ce résultat est également corrélé à l'analyse RMSF pour les petites fluctuations sur les résidus de 100 à 200 de PCNA se lie à CDK1.


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(b) L'analyse de la migration des complexes pendant le temps de simulation de 5000 ps : (a) la distance entre CDK1 et les protéines amarrées sur tout le temps MD et (b) l'analyse du déplacement quadratique moyen (MSD) pour tous les complexes CDK1 la valeur élevée de MSD dénote la grande distance de migration des protéines depuis la position initiale.


L'angle des dièdres des résidus de liaison des clés : (a) Gly9, (b) Ser10, (c) Ile11, (d) Leu12, (e) Lys13, (f) Lys14 et (g) Val15 sur la structure de la protéine CDK1 pendant le temps de simulation de 5000 ps. Les angles dièdres ont été calculés pour les complexes CDK1 avec des protéines de liaison cibles : Ki-67, p27 et PCNA sur tout le temps de simulation MD.

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(c) Analyses groupées de toutes les CDK1 et des protéines de liaison : (a) Ki-67, (b) p27 et (c) PCNA pendant le temps de simulation de 5000 ps, ​​les structures représentées ont été sélectionnées parmi les derniers groupes de regroupement pour toutes les trames MD des complexes CDK1 . La structure représentée du complexe Ki-67, p27 et PCNA déplacée à 4860 ps, ​​2740 ps et 3880 ps, ​​respectivement.

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(c) Comparaison entre l'instantané initial (0 ps) et la conformation représentée pour tous les complexes CDK1. (a) L'une des boucles CDK1 (verte) s'est déplacée vers Ki-67 (bleu) à 4860 ps. (b) La structure protéique de p27 (bleu) liée à CDK1 (vert) plus étroitement à 2740 ps. (c) L'une des boucles PCNA (bleue) s'est éloignée de CDK1 (vert) à 3880 ps.

Pour résumer les résultats de notre étude et des revues de la littérature, le mécanisme moléculaire de Ki-67, p27 et PCNA interagissant avec CDK1 pour la prolifération cellulaire et la transformation maligne chez les patients atteints d'IP nasosinusienne est montré dans la Figure 17.


4. Discussion

Bien que les papillomes inversés se soient rarement produits dans le tractus nasosinusien, mais la nature récurrente facile et la transformation maligne perturbent souvent les patients et les médecins. Un suivi régulier à vie est nécessaire pour la détection précoce d'une récidive ou d'un changement malin et pourrait conduire à un meilleur contrôle de la maladie pour les patients IP [9, 20].

Le Ki-67 a favorisé l'initiation de la phase G1 à partir de G0 dans les cellules IPs, et il a persisté l'expression du cycle cellulaire en phase de prolifération. Ki-67 est une protéine qui affecte le cycle cellulaire en phase de prolifération à partir de G1-S-G2-M à l'exception de la phase G0 [8, 11, 14]. Dans la littérature rapportant les mutations p53, p63, p21 et p27 induites par une IP nasosinusienne avec transformation du SCC, des débats restaient encore à débattre [6, 11, 14]. Le Ki-67 est récemment rapporté à la survenue de néoplasmes naso-sinusiens [21] le comportement agressif de la tumeur corrélé à un indice Ki-67 plus élevé et a causé l'épithélium nasal à une dysplasie sévère et même à un carcinome épidermoïde [22]. Le Ki-67 élevé pourrait même être trouvé dans les carcinomes épidermoïdes contenus de manière synchrone dans les IP. Ki-67 affectera également p21, p27 et CDK [8, 11, 12, 14]. Cependant, nous n'avons pas pu conclure si la diminution de p27 est causée par une expression élevée de Ki-67 dans les tissus IPs nasosinusiens. Une étude plus approfondie est nécessaire pour élucider la relation entre Ki-67 et P27.

La fonction de suppression tumorale de p53 est liée à de nombreux cancers rapportés par Katori et al. et Gujrathi et al. [22, 23]. Ils ont suggéré que le test de p53 peut aider à dépister les lésions du papillome avec un potentiel de dysplasie ou de carcinome, mais nous n'avons pas trouvé cela significatif dans l'analyse multivariée. Ceci est dû au nombre limité de patients dans notre étude. Cependant, non seulement p53 mais aussi p63 est élevé exprimé dans les IP avec transformation maligne [11].

Une activité proliférative accrue avec une expression élevée de Ki-67 des cellules tumorales a été signalée comme un marqueur pronostique important dans de nombreuses tumeurs humaines, il est également important dans la récurrence des IP et la cancérisation. En particulier, le suspect Ki-67 affecte directement le cycle cellulaire pendant la phase de prolifération et pourrait interagir avec les gènes suppresseurs de tumeur p53, p21 et p27 et moduler le cycle cellulaire en affectant le point de contrôle de la phase G1 [8, 24, 25]. Le Ki-67 a récemment découvert une interaction entre CDK1 dans la structure naturelle et la biologie moléculaire [26] et CDK1 joue le rôle principal dans la prolifération cellulaire et même la transformation maligne [10]. Nous soupçonnons que le Ki-67 a non seulement initié l'entrée des cellules IPs dans la phase G1 du cycle cellulaire, mais a également provoqué une transformation maligne dans les noyaux cellulaires en affectant le CDK1.

Les rôles cliniques de p21 et p27 dans la cancérisation du CEC de la tête et du cou font encore l'objet de débats, mais nous avons constaté que le niveau inférieur de p27 était également révélé dans les IP nasosinusiennes avec transformation maligne dans notre étude. Bien qu'il y ait eu peu d'études sur p21 et p27 rapportant la corrélation entre les IP humaines et la cancérisation, les débats subsistaient. Certains étaient avec Oncel et al. [11, 27] et certains étaient contre [25, 28] observés.

Outre Ki-67, nous avons également trouvé le PCNA, un prédicteur de la transformation maligne des IP dans la collaboration avec CDK1. Dans nos IP avec transformation maligne, le PCNA et le Ki-67 ont tous deux été élevés par les colorations IHC.

Comme l'expression élevée de PCNA l'a montré dans l'IP avec transformation maligne d'après notre enquête, nous avons suspecté que le PCNA était un facteur important pour induire la cancérisation chez les patients atteints d'IP nasosinusienne. Récemment, on a également trouvé le PCNA élevé dans IP par rapport aux polypes nasosinusiens de Mumbuc et al. [3]. Le PCNA pourrait interagir avec CDK1 et favoriser l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire pour la prolifération et la cancérisation qui en résultent.

Enfin, nous étudions le PLUNC aux IP naso-sinusiennes avec cancérisation car il est fréquemment rapporté qu'il est à l'origine de la formation du cancer du nasopharynx. Dans notre étude précédente, l'expression de PLUNC était diminuée dans la sinusite à pseudomonas en cas de maladie chronique [29]. Le PLUNC était également corrélé à la rhinosinusite chronique à colonisation bactérienne multiple [17]. Et, en plus, le PLUNC était également censé avoir une fonction anti-infectieuse et antibiofilm [30, 31]. Parce qu'il était supposé avoir un effet anticancéreux sur le carcinome du nasopharynx [32], mais nous n'avons trouvé aucune corrélation entre les IP nasosinusiennes et la transformation du CSC. Au contraire, nous n'avons pu trouver l'expression élevée de PLUNC que chez les patients présentant des IP nasosinusiennes avec des récidives multiples et une chirurgie de révision des sinus. Le mécanisme supplémentaire et les raisons de l'expression élevée de PLUNC et des récurrences multiples devraient être étudiés plus en détail à l'avenir.

La conception de médicaments assistée par ordinateur (CADD) peut être utilisée pour approfondir la recherche clinique ou sur les maladies, notamment la recherche sur les maladies [33], les études sur les facteurs de risque [34], les rapports de cas et le mécanisme moléculaire. Dans nos résultats d'amarrage et de dynamique moléculaire de PCNA, Ki-67 et p27 à CDK1, nous avons constaté que tous les trois avaient un amarrage stable à CDK1. Et le p27 était censé avoir une interaction plus stable avec le CDK1 pour fonctionner comme inhibiteur des IP nasosinusiennes avec cancérisation. Le PCNA et le Ki67 ont été considérés comme des promoteurs et favorisent la prolifération cellulaire et la cancérisation dans les IP nasosinusiennes.

En conclusion, il s'agit d'une première étude montrant que le Ki-67, le PCNA et le p27 sont tous importants dans les récidives IP et la cancérisation via CDK1. Et nous sommes également les premiers à trouver une expression PLUNC élevée dans les IP nasosinusiennes à récurrence multiple. Cependant, une étude plus approfondie des mécanismes est toujours justifiée à l'avenir. Les études informatiques actuelles sont toutes compatibles avec nos études en laboratoire humide, ce qui rend notre étude plus fiable et pourrait s'appliquer au traitement futur des patients atteints de cette maladie. Par conséquent, les patients présentant une IP nasosinusienne et exprimant un Ki-67 élevé, un PCNA et une diminution de p27 doivent être considérés comme ayant des possibilités plus élevées de transformation maligne et doivent être suivis de plus près en pratique clinique [35].

Conflit d'interêts

Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflit d'intérêts concernant la publication de cet article.

Remerciements

La recherche a été financée par des subventions du National Science Council of Taiwan (NSC101-2314-B-039-013-MY3, NSC102-2325-B039-001, NSC102-2221-E-468-027), de la China Medical University ( CMU102-BC-3), de l'Université d'Asie (ASIA100-CMU-2, ASIA101-CMU-2 et 102-ASIA-07) et du China Medical University Hospital (DMR-102-001, DMR-103-025, DMR-103-058, DMR-103-001 et DMR-103-096). Cette étude est également financée en partie par le Taiwan Department of Health Clinical Trial and Research Centre of Excellence (DOH102-TD-B-111-004) et le Taiwan Department of Health Cancer Research Centre of Excellence (MOHW103-TD-B-111-03 ) et CMU dans le cadre du plan universitaire supérieur du ministère de l'Éducation de Taïwan.

Les références

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Droits d'auteur

Copyright © 2014 Yung-An Tsou et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


Voir la vidéo: Les différences entre les rayons X, les ultrasons et la résonance magnétique (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Sawyere

    À mon avis, cela a déjà été discuté

  2. Brazshura

    Bravo, la phrase parfaite juste gravée

  3. Kajikree

    Et que faisons-nous sans tes brillantes idées

  4. Hassan

    Veuillez me dire - où puis-je trouver plus d'informations à ce sujet ?

  5. Maher

    Excusez-moi pour ce que je dois intervenir ... une situation similaire. Nous devons discuter.

  6. Tim

    Je crois que vous vous trompez. Je suis sûr. Discutons de cela. Envoyez-moi un courriel à PM.



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